核桃(Juglans regia L.)抗炭疽病基因类似物标记研究

摘要

核桃炭疽病(anthracnose)是核桃(Juglans regiaL.)的主要病害，给核桃生产业造成了严重危害，该病由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。开展核桃抗炭疽病分子辅助选择，选育抗性种质是我国核桃育种的迫切需要。本研究根据抗病基因的保守性设计简并引物，研究了核桃NBS、LRR和STK抗病基因类似物标记(resistancegene analogs，RGA)，这对于核桃抗炭疽病相关基因克隆和抗炭疽病的分子辅助选择具有重要的现实意义。研究结果如下:
　　 1，根据已知抗病基因的NBS域、LRR域和STK域等保守域设计了8对兼并引物，扩增核桃基因组DNA中的抗病基因类似物。结果显示，3对引物组合P-loop/GLPL、NLRR inv1/inv2和Pto kin1/kin2能够扩增出目的条带。回收目的条带，连接、转化和测序，得到了35个NBS序列、45个STK序列和47个LRR序列，这些RGA标记均与杂交群体的抗病性共分离。
　　 2，NBS类RGA标记:引物P-loop/GLPL扩增出约500bp的DNA片段。BLAST结果显示，所得NBS序列与多个物种的NBS型抗病基因具有较高相似性，核苷酸相似性为67％-88％;氨基酸相似性为46％-73％;35个NBS序列分析表明，所得序列均具有典型的NBS功能域，将其命名为jrRGAPGs，GenBank登录号为:JX646704-JX646738。在35个NBS序列中，有32条具有完整开放阅读框（ORF），推导氨基酸序列分析表明，这32条序列都包含NBS类抗病基因所特有的保守结构域，如P-loop、kinase-2a、kinase-3a和GLPL等。基于核苷酸序列的NJ系统发育树可将NBS序列分为10类;基于推导氨基酸序列的NJ发育树可将其分为TIR和non-TIR两个亚类;在相似系数为0.1时，UPGMA聚类分析也将NBS序列分为10个小组。氨基酸序列相似性表明，核桃NBS序列各小组间相似度为23.1％-75％，与已知抗病基因相应区域相似性为20.6％-51.9％。NBS核苷酸序列多态性(Pi）分析表明，所得NBS序列在其保守功能域的Pi明显低于其它区段，进一步证明了NBS功能域的高度保守性;dN/dS分析表明，大部分核桃NBS序列的dN/dS比值集中在0-0.933＜1，为纯化选择(purifying selection)，只有RGAⅧ的dN/dS=1.552＞1为正向选择(positive selection)，核桃NBS序列的进化受不同自然选择压力的影响;推导氨基酸的二级及3D模型显示，所得NBS序列具有复杂的骨架结构，其中α螺旋结构(Helices)占53.55％，卷曲结构(Coils)占43.17％，线状结构（Strands）占3.28％。
　　 3，LRR类RGA标记:以NLRR inv1/inv2为引物，PCR扩增获得约500bp和2000bp的DNA片段，回收500bp的目的片段，共得到47条LRR序列，将其命名为jrRGANLs，GenBank登录号为:KF151270-KF151316。BLAST结果显示，所得LRR序列在GenBank中无同源性序列，且47条LRR序列之间也表现出较高的多态性。系统发育分析显示，所得核桃LRR核苷酸序列可划分为多个小组，氨基酸序列系统发育树将其分为两大类3个小组。
　　 4，STK类RGA标记:以Pto kin1/kin2为引物，PCR扩增获得约750bp的DNA片段，对其进行回收、连接转化和测序，共获得45条STK序列，GenBank登录号为:KF151225-KF151269。BLAST结果显示，所得STK序列与多个物种的蛋白激酶受体具有相似性(89％-93％)。对这45条STK序列的推导氨基酸序列分析表明，这45条STK序列具有8个保守催化结构(Ⅰ-Ⅷ)。ORF分析表明所得STK序列均含有多个终止子。
　　 5，核桃RGA标记的定位:利用JoinMap3.0软件构建核桃RGA标记与抗病基因位点的连锁遗传图，发现3种不同类型的RGA标记与核桃抗病基因位点相连锁，NBS、LRR、STK标记与R位点的遗传距离分别为16.22 cM、24.49 cM和3.06 cM。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 核桃炭疽病研究进展

1．2 植物抗病基因研究进展

1．2．1 植物的抗病性

1．2．2 植物R基因的结构特征及分类

1．2．3 植物抗病基因的分离方法

1．2．4 植物RGA标记研究进展

1．3 本研究目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂与设备

2．2 试验方法

2．2．1 核桃炭疽病抗性评价

2．2．2 核桃基因组DNA的提取

2．2．3 DNA浓度及纯度检测

2．2．4 核桃RGA引物设计、PCR扩增、克隆及测序

2．2．5 核桃RGA序列分析

3．结果与分析

3．1 核桃炭疽病抗性评价

3．2 核桃基因组DNA的提取

3．3 核桃RGA的扩增

3．3．1 核桃NBS序列的扩增

3．3．2 核桃LRR序列的扩增

3．3．3 核桃STK序列的扩增

3．4．4 核桃RGA标记与杂交后代抗病性状的卡方检验

3．4 目的片段的回收、连接、转化及阳性克隆的鉴定

3．4．1 核桃NBS序列菌液验证

3．4．2 核桃LRR序列菌液验证

3．4．3 核桃STK序列菌液验证

3．5 核桃RGA序列分析

3．5．1 核桃NBS序列分析

3．5．2 核桃LRR序列分析

3．5．3 核桃STK序列分析

3．5．4 核桃RGA序列的连锁作图

4．讨论

4．1 关于核桃炭疽病抗性评价

4．2 抗病基因类似物标记与植物的抗病性

4．3 核桃的NBS标记

4．4 核桃的LRR标记

4．5 核桃的STK标记

4．6 核桃RGA标记的定位

5．结论

参考文献

附录：相关试剂的配制

致谢

攻读学位期间发表的学术论文