J亚群禽白血病病毒gp85重组亚单位疫苗对鸡群的免疫保护作用

摘要

J亚群禽白血病是由反转录病毒引起的高度传染性疾病，该病最初发现于我国肉用鸡群，近几年大量报道显示在我国蛋鸡及地方品系鸡群中也发现ALV-J的感染。为了保护我国优良地方品系鸡，控制和预防ALV-J在中国地方种鸡中的流行，国家开始对我国地方种鸡实施净化的战略决策。由于我国种鸡品系和种群数量大、饲养不规范和饲养密集等特点，可能需要较长时间的净化才能达到感染率非常低的防控要求。为加快这一净化进程，需要探索多种防治方法和措施来降低鸡群的ALV-J感染率。使用疫苗预防是一种有效的可选择方法，但对ALV-J至今尚未有有效的疫苗在生产中加以应用，能否研制有效的ALV-J疫苗需要科学探索。
　　 本研究根据已发表的ALV-J囊膜蛋白gp85基因序列，设计一对特异性引物。从分离自我国肉鸡样品的ALV-J NX0101毒株eDNA中扩增目的基因，并通过双酶切及测序鉴定。该目的基因连接至pET32a(+)原核表达载体，并将重组表达载体转化至E.coli，经IPTG诱导后获得大量稳定表达的重组目的蛋白。使用Ni柱纯化方法对获得的目的蛋白进行纯化，使用ALV-J单克隆抗体进行Western-blot分析。把纯化后的重组蛋白与不同佐剂(F佐剂和C佐剂)进行乳化、混合，制备多种ALV-J重组亚单位疫苗。使用这些亚单位疫苗分别免疫7日龄雏鸡和300日龄种鸡，首次免疫后2-3周进行二次加强免疫，每周检测血清中ALV-J抗体水平，二次免疫后分别对雏鸡进行攻毒试验，种鸡进行人工受精并采集受精卵，对孵化雏鸡1日龄进行攻毒试验。对攻毒后的雏鸡进行病毒血症检测和免疫抑制等病变的观察，评价重组蛋白亚单位疫苗对雏鸡的免疫保护效果，同时对血清抗体进行体外病毒中和试验。结果显示:
　　 (1)通过PCR扩增获得大小为909bp的gp85目的基因，通过原核表达系统进行重组蛋白的诱导表达，获得大小为53KD并能与ALV-J单克隆抗体发生特异性结合的重组蛋白。
　　 (2)使用重组亚单位疫苗分别与F佐剂和C佐剂联合免疫7日龄雏鸡后，全部鸡只产生具有一定中和作用的血清抗体，二次加强免疫能够显著提高抗体滴度和延长有效抗体维持时间，C佐剂和F佐剂分别与亚单位疫苗联合免疫组降低病毒血症的保护率分别为53.8％和66.7％，对ALV-J免疫致病性也有一定的降低作用。
　　 (3)使用F佐剂和C佐剂联合重组亚单位疫苗能够诱导母鸡产生较高水平的血清抗体和卵黄抗体及雏鸡血清抗体（母源抗体），这种母源抗体对雏鸡早期抗ALV-J感染的保护率分别为60％和75％，并降低了ALV-J的致病性。
　　 以上结果表明，通过原核表达获得的重组蛋白联合不同佐剂可以诱导雏鸡和种母鸡获得一定中和作用的血清抗体，对预防ALV-J早期感染具有一定的保护作用。该研究为ALV-J亚单位疫苗在种鸡净化过程中的应用研究提供科学依据。

目录

声明

论文说明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 ALV生物学特征

1．2 禽白血病病毒的基因结构

1．3 ALV-J流行病学

1．4 ALV-J的致病性

1．5 ALV-J的诊断检测方法

1．6 我国ALV-J的防治现状

1．7 疫苗在ALV防治中的应用探索

1．8 疫苗免疫佐剂的研究概况

1．9 本研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试剂与仪器

2．1．1 主要试剂

2．1．2 仪器及耗材

2．1．3 实验地点

2．2 方法

2．2．1 ALV-J gp85基因的表达及蛋白的纯化鉴定

2．2．2 gp85重组蛋白联合不同佐剂免疫雏鸡诱导免疫保护性研究

2．2．3 gp85重组蛋白联合不同佐剂免疫种鸡诱导产生母源抗体保护性研究

3．结果

3．1 ALV-J gp85基因的原核表达

3．1．1 ALV-J gp85基因克隆PCR产物的鉴定

3．1．2 ALV-J gp85基因原核表达载体的构建

3．1．3 gp85蛋白的诱导表达、纯化及免疫原性鉴定

3．2 ALV-J gp85重组蛋白与免疫佐剂联合接种雏鸡诱导免疫保护的研究

3．2．1 不同免疫佐剂和免疫次数对gp85重组蛋白诱导生成抗体的作用

3．2．2 不同免疫佐剂和免疫次数对gp85重组蛋白诱导抗体阳性鸡只比例的变化

3．2．3 不同免疫的鸡只攻毒后病毒血症的变化

3．2．4 不同免疫的鸡只攻毒后健康状况检测

3．2．5 病毒中和试验

3．3 ALv-J gp85重组蛋白与C佐剂联合接种种鸡诱导产生母源抗体对雏鸡抗ALV-J早期感染的保护性研究

3．3．1 不同免疫佐剂对gp85重组蛋白诱导产蛋母鸡生成抗体的作用

3．3．2 卵黄及雏鸡中母源抗体的检测

3．3．3 母源抗体保护性研究

3．3．4 攻毒后健康状况检测

3．3．5 疫苗安全性评估

4 讨论

4．1 ALV-J gp85基因的表达

4．2 免疫佐剂对抗原的增强作用

4．3 疫苗在种鸡净化工作中的应用

5．结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文