抗猪流感病毒单味中药的体外筛选

摘要

猪流感(Swine influenza, SI)是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus，SIV）引起的一种严重影响养猪业的急性、呼吸系统疾病，是规模化养猪场普遍发生的传染病之一。其特点是发病率高，死亡率低，但常继发其他细菌和病毒的感染，导致疾病加重，死亡率增高。同时，猪还可以作为流感病毒种间传播的中间宿主，因而具有重要的公共卫生学意义。目前防治猪流感的措施主要是疫苗免疫和使用抗病毒药物，但由于流感病毒惊人的变异速度以及西药所产生的耐药性，对于该病的防治面临严峻的考验。因此，筛选安全有效的抗猪流感病毒中药对养猪业发展具有重要意义。
　　 本研究的目的在于筛选具有抗流感病毒作用的中药，从中选择抑制效果显著的药物并对其抗病毒机制进行初步探索，研究结果将为进一步研究以及开发有效、特异的防治流感病毒感染的药物奠定实验基础。
　　 方法:利用对流感病毒敏感的犬肾细胞株（MDCK细胞）建立抗猪流感病毒单味中药的体外筛选模型。以常规水煎法提取中药的有效成分，制备成0.5g/ml的提取液，以利巴韦林为阳性对照药物，用细胞病变(CPE)观察法、噻唑蓝盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活性，对药物抗猪流感病毒的效果进行评价。首先测试药物在MDCK细胞的毒性作用及最大安全浓度，在安全浓度范围内进行药物的抗病毒筛选试验。通过感染前后均给药的方式，进行初筛试验。通过改变给药时间及作用方式初步探讨药物抗病毒作用环节。最后测定其最小有效浓度。
　　 结果显示:药物最大安全浓度在0.24mg/ml～31.25mg/ml之间。其中苦参的最大安全浓度高，31.25mg/ml时仍不表现毒性作用。初筛具有抗病毒效果的是:柴胡、蒲公英、穿心莲、苦参、黄柏、地丁、大青叶、茵陈、野菊花、黄芩、白头翁、连翘、细辛13种。抗病毒作用环节的研究初步表明:(1)能够抵抗病毒吸附的有:穿心莲、苦参、黄柏、大青叶、连翘。其效果均优于利巴韦林。(2)能够干扰病毒复制的有:柴胡、蒲公英、穿心莲、苦参、黄柏、地丁、大青叶、茵陈、野菊花、黄芩、白头翁、连翘、细辛。(3)同时接触细胞能发挥抗病毒效果的有:柴胡、蒲公英、穿心莲、苦参、黄柏、地丁、大青叶、茵陈、野菊花、黄芩、白头翁、连翘，其中蒲公英、苦参、黄柏、地丁、大青叶、黄芩效果优于利巴韦林。(4)起直接杀灭作用的有柴胡、蒲公英、穿心莲、苦参、黄柏、地丁、大青叶、茵陈、野菊花、黄芩、连翘。其中柴胡和苦参效果优于利巴韦林。中药的最小有效浓度分布在0.06～7.8mg/ml之间，其中黄芩的最小有效浓度最低，为0.06mg/ml。药物的治疗指数在1～32之间，其中黄芩的治疗指数最高，为32。

目录

声明

符号说明

摘要

1．引言

1．1 猪流感研究进展

1．1．1 病原学

1．1．2 流行特点

1．1．3 症状

1．1．4 病理变化

1．1．5 猪流感病毒种种间传播及公共卫生意义

1．2 猪流感防治研究进展

1．2．1 猪流感疫苗研究进展

1．2．2 抗流感病毒药物研究进展

1．3 中药抗病毒作用研究进展

1．3．1 抗病毒中药及其临床应用现状

1．3．2 中药抗病毒作用机理方面的研究

1．4 药物筛选模型研究进展

1．4．1 整体水平筛选模型

1．4．2 组织器官水平筛选模型

1．4．3 细胞、分子水平药物筛选模型

1．5 本课题研究的目的意义和设计思路

1．5．1 建立抗猪流感病毒药物的筛选模型

1．5．2 备筛药物的选择及提取方法的确定

1．5．3 抗猪流感病毒药物筛选试验

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 病毒

2．1．2 单昧中草药

2．1．3 利巴韦林

2．1．4 细胞

2．1．5 主要试剂

2．1．6 主要仪器设备

2．2 相关溶液制备

2．3 试验方法

2．3．1 抗病毒猪流感病毒单昧中药筛选模型的建立

2．3．2 中药水煎剂在MDCK毒性作用的测试

2．3．3 利巴韦林注射剂在MDCK细胞上毒性作用的测试

2．3．4 抗病毒中药在MDCK细胞上的初步筛选

2．3．5 中药作用机制的初步探索试验

2．3．6 药物最小有效量的测定

2．3．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 猪流感病毒血凝效价测定结果

3．2 猪流感病毒致MDCK细胞病变情况观察

3．3 猪流感病毒在MDCK细胞上毒力的测定

3．4 中药水煎剂在MDCK细胞上毒性作用的结果

3．4．1 同一种中药不同浓度对细胞的毒性试验

3．4．2 不同药物对细胞的毒性试验

3．5 利巴韦林对MDCK毒性作用的研究结果

3．6 中药水煎剂抗病毒效果初步筛选的结果

3．7 药物作用机制的初步探索结果

3．7．1 先给药再感染病毒组试验结果

3．7．2 先感染病毒再给药组试验结果

3．7．3 药物与病毒混合后同时作用于细胞试验结果

3．7．4 药物与病毒混合后作用2h再加入细胞

3．7．5 各种药物不同作用方式效果

3．8 药物最小有效剂量的测定

3．9 药物治疗指数

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢