嗜肺军团菌重组蛋白PIP-Linker-MOMP的制备及其在血清学诊断中的研究

摘要

目的:以嗜肺军团菌的pip基因和momp基因构建原核重组质粒pET-plm，诱导表达的PIP-Linker-MOMP(PLM)蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA方法进行血清学检测，评价其在诊断嗜肺军团菌感染中的可行性及应用价值。
　　方法:以重组质粒pET-pip和pET-momp为模板，PCR扩增得到pip基因和momp基因，定向克隆至载体质粒pET-32a(+)中，构建重组质粒pET-plm，并经限制性内切酶、PCR及核酸测序分析鉴定。将构建的原核重组质粒pET-plm转化至大肠杆菌BL21内，经过IPTG的诱导表达，产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定分析。将纯化的重组蛋白PLM作为包被抗原，通过十字交叉连续稀释分析法筛选出最佳包被抗原的浓度，建立间接ELISA方法，检测32例健康人血清、58例军团病疑似患者中抗嗜肺军团菌抗体IgG、IgM、IgA水平，然后分别与德国DRG公司的Legionella ELISA试剂盒和美国R&D公司Human LPIgG-Ab ELISA Kit/ Human LPIgM-Ab ELISA Kit/ HumanLP IgA-Ab ELISA Kit检测结果进行配对设计资料的RO C曲线分析，以此来评价嗜肺军团菌重组蛋白PLM在军团病诊断中的可行性。
　　结果:扩增出了嗜肺军团菌723bp的pip基因和830bp的momp基因，构建的重组质粒pET-plm将其基因测序结果提交GeneBank经Blast比对,结果表明表达载体中插入的核酸序列与所选取嗜肺军团菌LP1型菌株的相应核酸序列具有98％的同源性,11个碱基位点发生改变，1个氨基酸位点发生改变，由于两种氨基酸同为疏水性氨基酸以及结构较相似，对蛋白质的空间结构和功能影响不大，对抗原表位基本没有影响。表达并纯化出了67KD左右的融合蛋白PLM，纯化的蛋白浓度达到728μg/mL。用以纯化蛋白PLM作为包被抗原建立的间接 ELISA检测方法分别检测血清中Lp特异性 IgG、IgM、IgA抗体。与DRG IgG/M/A试剂盒比较：灵敏度92.6%，特异度92.1%，一致性Kappa值0.821（P<0.05），ROC曲线下面积0.923。与ELISA试剂盒（R&D）进行比较：IgG抗体灵敏度91.7%，特异度90.9%，一致性Kappa值0.784（P<0.05），ROC曲线下的面积0.913；IgM抗体灵敏度90.6%，特异度93.1%，一致性Kappa值0.831（P<0.05），ROC曲线下的面积为0.919；IgA抗体灵敏度88.9%，特异度92.1%，一致性Kappa值0.793（P<0.05），ROC曲线下的面积0.905。
　　结论:成功构建了嗜肺军团菌重组质粒pET-plm，诱导表达并纯化出融合蛋白PLM，纯化蛋白PLM作为诊断抗原对军团病疑似患者血清和健康人血清进行诊断，显示出较好的特异度、灵敏度和一致性，为目前军团病的血清学诊断方法的改进提供了较好的参考价值，为军团病的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。

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前言

第一部分 嗜肺军团菌pip基因和momp基因原核表达重组质粒的构建

引言

材料与方法

3. 结果

4. 讨论

附图

第二部分 嗜肺军团菌融合蛋白PLM的表达、纯化和定量检测

引言

材料与方法

3. 结果

4. 讨论

附图

第三部分 嗜肺军团菌重组蛋白PLM间接ELISA方法的建立和血清学检测

引言

材料与方法

3 统计学方法

4. 实验结果

5. 讨论

附表

全文总结

论文参考文献

嗜肺军团菌研究进展

综述参考文献

致谢

攻读硕士研究生期间发表的文章