乙烯调控早熟苹果果实软化和裂果机理的初步研究

摘要

由硬度和脆度构成的果实质地品质是苹果品质的重要构成因素之一。它不仅影响苹果的鲜食品质，也是限制苹果贮运品质的重要因素。因此探讨苹果质地品质形成的机理也具有重要的意义。本课题组育成的早熟苹果新品种‘泰山早霞’综合经济性状优良，但依然存在果实容易软化变绵这一早熟苹果的共性问题，特别是全红期采收的果实在室温条件下存放3～5d后就软化变绵甚至裂果，严重影响了苹果的品质。因此研究早熟果实质地品质的形成机理，改善早熟苹果果实质地品质是当前培育优质早熟苹果品种急需解决的问题。
　　 本文以‘泰山早霞’苹果为试材，分别测定果实生长发育期和贮藏期以及采后用乙烯抑制剂1-MCP处理果实的内源乙烯合成，PG酶活性和果实硬度的变化。克隆了五个乙烯信号转导途径的调控基因（ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3、ZMdERF1和ZMdERF2）和一个功能基因ZMdPG1，并研究乙烯信号调控基因和ZMdPG1在苹果果实生长发育和成熟软化过程中的表达模式，以及对1-MCP(1.0μl·L-1)处理的应答模式，鉴别参与苹果果实成熟软化的重要基因;验证乙烯信号转导途径调控基因和功能基因ZMdPG1的作用;初步探索乙烯信号编码基因对功能基因ZMdPG1的调控作用，明确乙烯与苹果果实软化和裂果的关系。主要研究结果如下:
　　 1.‘泰山早霞’果实成熟过程中，内源乙烯大量积累，PG酶活性急剧增加，果实硬度快速下降;乙烯抑制剂1-MCP能够抑制内源乙烯合成，同时PG酶活性下降，果实硬度软化趋势被延缓，果实裂果现象也被抑制。
　　 2.在‘泰山早霞’果实整个发育过程中ZMdERF1基因持续性表达;ZMdEIL2基因的表达量在果实发育前期和后期均较高，中期比较低;而且，ZMdERF1和ZMdEIL2基因的表达丰度均在花后65d即内源乙烯开始大量积累时增高;ZMdERF2基因的表达量在花后75d升高;ZMdE IL1和ZMdEIL3基因的表达量在果实的整个发育过程中都较低。ZMdPG1基因的表达量在果实生长发育过程中较低，在软化果实和裂果果实中显著增强。用乙烯抑制剂1-MCP处理果实后，伴随着内源乙烯积累的迅速降低，ZMdPG1、ZMdERF1、ZMdEIL1和ZMdEIL2基因的转录明显被抑制，ZMdERF2的表达也降低，ZMdEIL3基因的表达未有明显的变化。ZMdPG1、ZMdERF1、ZMdERF2和ZMdEIL2基因的表达响应内源乙烯的调控，并协同调节苹果果实的成熟软化和裂果。
　　 3.利用RT-PCR技术克隆了ERFs家族的ZMdERF1和ZMdERF2，EIN3/EILs家族的ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3和功能基因ZMdPG1;其中，ZMdERF1和ZMdERF2的氨基酸序列包含ERFs家族的两个保守区域YRG和RAYD，ZMdEIL1、ZMdEIL2和ZMdEIL3的氨基酸序列含有EIN3/EILs家族的特征元件AD、BDⅠ、BDⅡ、BDⅢ、BDⅣ、BDV和PR，并采用High-tail PCR克隆得到ZMdP G1的启动子，它包含有多个调控元件，如:A-box、AT-rich sequence、 BoxⅠ、G-Box、BoxⅢ、CCGTCC-box、CGTCA-motif等。亚细胞定位显示ZMdEIL1、ZMdEIL2、ZMdEIL3、ZMdERF1和ZMdERF2均定位在细胞核内，ZMdPG1定位在细胞壁和细胞质膜中。
　　 4.在拟南芥中超表达ZMdP G1基因，加速了果皮细胞壁的降解，细胞与细胞之间的结合力减弱从而引发果皮缝合处的细胞分离，导致果荚提早开裂，而反义ZMdP G1转基因拟南芥抑制了果荚正常开裂。在番茄中超表达ZMdP G1基因引起大量落花和果实不完全发育。
　　 5.ZMdP G1启动子上含有多个调控元件，其中包括蛋白结合元件BOXⅢ，但由ZMdP G1启动子合成的探针不与ZMdERF1蛋白结合，表明ZMdERF1不直接调控目的基因ZMdPG1。
　　 6.苹果乙烯信号编码基因之间存在相互作用，ZMdERF1/ZMdEIL2组合之间和ZMdERF2/ZMdEIL2组合之间分别存在互补关系，表明ZMdERF1蛋白和ZMdERF2蛋白特异的与ZMdEIL2蛋白互作。

目录

声明

中英文缩略表

摘要

1 前言

1．1 乙烯的生理作用

1．1．1 乙烯调节种子休眠和萌发

1．1．2 乙烯诱导三重反应

1．1．3 乙烯促进衰老与脱落

1．1．4 乙烯促进果实成熟与软化

1．1．5 乙烯调控胁迫反应

1．2 乙烯生物合成

1．2．1 乙烯生物合成途径

1．2．2 乙烯生物合成相关酶和编码基因的功能

1．2．3 乙烯生物合成与果实成熟衰老的调控

1．3 乙烯信号转导

1．3．1 乙烯信号转导线性模型建立

1．3．2 乙烯信号转导元件

1．4 细胞壁代谢与果实成熟

1．4．1 PG酶促进果实成熟软化和脱落

1．4．2 植物激素对PG活性的调节

1．4．3 PG基因与果实成熟软化

1．5 1-MCP的作用和应用

1．6 研究的目的和意义

1．7 研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料及生长条件

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 酶及生化试剂

2．1．4 PCR引物

2．2 实验方法

2．2．1 乙烯释放的测定

2．2．2 多聚半乳糖醛酸酶(PG酶)活性测定

2．2．3 总RNA提取

2．2．4 反转录cDNA第一链的合成

2．2．5 基因组DNA的提取及纯化

2．2．6 半定量RT-PCR分析

2．2．7 PCR扩增

2．2．8 PCR产物的回收

2．2．9 连接反应

2．2．10 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及碱法小量质粒DNA的提取

2．2．11 根癌农杆菌感受态细胞的制备与转化

2．2．12 DNA序列测定

2．2．13 表达载体的构建

2．2．14 农杆菌介导的遗传转化

2．2．15 转基因材料的鉴定

2．2．16 亚细胞定位

2．2．17 双分子荧光互补

2．2．18 半薄切片

2．2．19 蛋白质技术

2．2．20 凝胶阻滞试验(EMSA)

3 结果与分析

3．1 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实乙烯合成、果实硬度和PG酶活性变化

3．1．1 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实乙烯合成

3．1．2 ‘泰山早霞’和‘辽伏’果实PG酶活性变化

3．1．3 ‘泰山早霞’果实软化和裂果

3．2 ZMdERFs、ZMdEILs和ZMdPG1基因表达量分析

3．3 ZMdERFs、ZMdEILs和ZMdPG1基因克隆与序列分析

3．3．1 ZMdERFs基因克隆与序列分析

3．3．2 ZMdEILs基因克隆与序列分析

3．3．3 ZMdPG1基因克隆与序列分析

3．3．4 ZMdPG1基因启动子克隆与序列分析

3．4 ZMdERFs、ZMdEILs和ZMdPG1亚细胞定位

3．5 转基因功能分析

3．5．1 转基因拟南芥GUS染色分析

3．5．2 35S∶ZMdPG1转基因拟南芥功能分析

3．5．3 GUS染色分析

3．5．4 转基因番茄功能分析

3．6 凝胶阻滞电泳试验(EMSA)分析

3．6．1 ZMdERF1和ZMdERF2原核表达分析及蛋白诱导纯化

3．6．2 ZMdERF1蛋白与ZMdPG1启动子的EMSA分析

3．7 ZMdERFs和ZBdEILs双分子荧光互补分析

3．7．1 ZMdERFs和ZMdEILs双分子荧光互补表达载体构建

3．7．2 ZMdERFs和ZMdEILs双分子荧光互补分析

4 讨论

4．1 乙烯促进苹果果实软化和裂果

4．2 乙烯调控ZMdERFs、ZMdEILs和ZMdPG1基因

4．3 ZMdPG1基因起始果实软化和裂果

4．3 ZMdPG1导致落花和果实不完全发育

4．5 探讨乙烯信号对果实软化和裂果的调控机理

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 推论

5．3 展望

参考文献

7 附录

攻读学位期间完成的论文

致谢