5-氨基酮戊酸脱水酶基因的克隆表达及与大蒜绿变关系的研究

摘要

大蒜(AlliumSativumL.)为百合科葱属多年生草本植物，其营养价值较高，风味独特，具有广泛的用途。大蒜在生产加工过程中常会出现绿变现象，严重地影响了产品外观和品质，妨碍了开拓大蒜精深加工和高附加值市场，造成大蒜加工企业严重的经济损失。目前，对大蒜绿变机理的研究主要集中在采用体外模拟化学合成或通过化学方法等途径，不能有效的揭示大蒜绿变的分子途径。已有研究表明大蒜绿色素含有吡咯环，但其生成途径未知。因此，从分子水平上对与吡咯基化合物合成相关酶的基因的研究对阐明绿变机理具有重要的意义。本试验以大蒜为原料，成功克隆到邳州白蒜生成吡咯基化合物PBG的重要酶5-氨基酮戊酸脱水酶的部分cDNA序列，并对不同温度、不同品种下该基因进行了表达特性分析、活性测定及PBG含量、绿变强度的研究，探讨了ALAD与大蒜绿色素生物合成途径的关系。主要研究结果如下:
　　1.根据GenBank中登记的其他植物氨基酸的保守序列设计兼并引物并通过RT-PCR和RACE技术从大蒜中克隆到了部分ALAD基因，长度为1251bp，编码400个氨基酸。
　　2.对室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜进行ALAD基因表达和酶活性测定后显示:室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD基因表达没有明显差别，而活性差距较大，可知ALAD酶活性存在转录后水平的调节，存在品种差异。
　　3.对低温(4℃)和室温(23～25℃)下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜进行ALAD基因表达、酶活性、PBG含量及大蒜绿变强度测定后发现:低温(4℃)对大蒜ALAD基因表达存在一定影响，4℃下邳州白蒜最大表达量约为对照组14.2倍，苍山蒲棵大蒜约为对照组1.9倍。ALAD活性变化与PBG含量及大蒜绿变一致，ALAD合成大蒜体内吡咯基化合物PBG，与大蒜绿变密切相关。

目录

声明

符号和缩略词说明

摘要

1 引言

1．1 大蒜概述

1．1．1 大蒜的化学成分

1．1．2 大蒜的重要生理功能

1．2 大蒜的生理休眠

1．3 大蒜产业的现状及前景

1．4 国内外有关大蒜绿变的研究

1．4．1 大蒜绿色素的性质

1．4．2 烷基-吡咯基氨基酸与大蒜绿变

1．4．3 呼吸代谢与大蒜绿变

1．4．4 大蒜绿色素的结构解析

1．4．5 三羧酸循环与大蒜绿变

1．5 卟啉合成共有途径酶类研究进展

1．5．1 胆色素原脱氨酶(Porphobilinogen deaminase，PBGD)

1．5．2 尿卟啉原Ⅲ合酶(Uroporporphyrinogn Ⅲ synthase，UROS)

1．5．3 5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase，ALAD)

1．6 本课题研究目的和意义

1．6．1 研究目的

1．4．3 研究意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 试剂盒和酶

2．1．4 生化试剂及实验仪器

2．1．5 培养基

2．1．6 PCR引物

2．2 试验方法

2．2．1 总RNA的提取

2．2．2 总RNA的检测

2．2．3 反转录cDNA模板

2．2．4 通过3’RACE获得3’端序列

2．2．5 通过5’RACE获得5’端序列

2．2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．2．7 目的片段的回收

2．2．8 连接反应

2．2．9 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化

2．2．10 碱法提质粒

2．2．11 质粒DNA酶切验证

2．2．12 cDNA片段的测序及序列分析

2．2．13 实时荧光定量PCR

2．2．14 大蒜绿变强度定义及测定方法

2．2．15 5-氨基酮戊酸脱水酶的测定方法

2．2．16 胆色素原的测定方法

3 结果与分析

3．1 大蒜总RNA的提取

3．2 大蒜5-氨基酮戊酸脱水酶基因的克隆

3．2．1 大蒜5-氨基酮戊酸脱水酶基因中间片段的克隆

3．2．2 5-氨基酮戊酸脱水酶基因3’端的克隆

3．2．3 5-氨基酮戊酸脱水酶基因5’端的克隆

3．3 ALAD基因序列分析

3．4 5-氨基酮戊酸脱水酶活性变化

3．4．1 不同贮藏温度下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD活性变化

3．4．2 室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD活性变化

3．5 胆色素原含量的变化

3．5．1 不同贮藏温度下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜PBG含量变化

3．5．2 室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜PBG含量变化

3．6 5-氨基酮戊酸脱水酶基因的表达

3．6．1 不同贮藏温度下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD基因表达

3．6．2 室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜ALAD基因表达

3．7 大蒜绿变强度变化

3．7．1 不同贮藏温度下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜绿变强度变化

3．7．2 室温下邳州白蒜和苍山蒲棵大蒜绿变强度变化

4 讨论

4．1 关于大蒜RNA的提取

4．2 关于5’race

4．3 关于ALAD基因表达与酶活性

4．4 进一步研究方向

5 结论

参考文献

致谢