三种处理诱导桃树芽自然休眠快速解除机制的研究

摘要

自然休眠是落叶果树为抵御冬季寒冷环境发展出的一种生物学特性，其解除需要一定时间的低温积累。低温积累不足会导致芽萌发及后续枝叶生长异常，严重影响树体生产能力。由于这一特性，自然休眠严重限制了设施果树生产及温暖地区的落叶果树的栽培生产。目前对休眠解除机制的研究已涉及生理、生态、生化、分子生物学等多个领域，研究还发现除低温外许多处理也具有快速打破自然休眠的作用。为探讨自然休眠快速解除的机制及关键调控因子，为安全、高效快速破眠技术的开发提供参考，本研究选择三种不同类型的破眠处理，50℃高温（物理类）、单氰胺（化学类）和TDZ（生长调节剂类），对其破眠过程进行了研究。
　　 许多研究表明呼吸代谢、H2O2代谢和Ca2+在休眠解除过程中都发生标志性变化，而Ca2+又是细胞分裂重要的调控因子，因此，本研究也围绕这三个因子在休眠解除中的地位和相互关系展开。试验于2010年～2013年在山东农业大学园艺学院进行，以‘曙光’油桃（Prunus persica var.nectariana cv.Shuguang）为试验材料。试验分析了休眠芽的细胞周期特点，研究了三种破眠处理的破眠作用及对H2O2代谢、呼吸代谢和激素含量的影响，并检测了破眠剂单氰胺、TDZ及信号物质H2O2对芽休眠组织Ca2+转运的影响。初步总结了休眠快速解除过程中呼吸代谢、H2O2代谢和Ca2+的关系。主要结果如下:
　　 1.芽分生组织在萌芽期同时存在二倍体细胞群(G1期)和四倍体细胞群(G2期)，而在自然休眠期没有明显的四倍体(G2期)细胞群，染色体复制受到抑制。
　　 2.三种破眠处理中50℃高温和单氰胺破眠效果较好，而TDZ破眠效果较差。对于花芽，单氰胺处理后芽萌发最早、萌芽率最高，50℃高温次之，TDZ最差;而对于叶芽，50℃高温破眠效果最好，单氰胺次之，TDZ最差。单氰胺对枝条和芽具有显著的毒害作用，主要表现为枝条颜色改变、枝梢干枯、芽及周围组织坏死、脱落等。
　　 3.自然休眠期，芽分生组织细胞内Ca2+大量分布于细胞核和细胞质基质区域，质膜钙通道活跃，组织对Ca2+呈现吸收状态。低浓度的单氰胺和TDZ对休眠芽分生组织Ca2+转运影响较小，但在有效破眠浓度下，单氰胺能够显著降低组织对Ca2+的吸收速率，TDZ则显著提高组织对Ca2+的吸收速率。
　　 4.50℃高温和单氰胺都能抑制休眠芽CAT表达和CAT活性，并引起H2O2积累，但对POD活性影响不大。50℃高温引起的CAT活性抑制和H2O2积累发生较早，持续时间较短，单氰胺引发的CAT抑制和H2O2积累发生较晚，持续时间也较长。 TDZ对芽内H2O2含量、CAT活性、POD活性均未表现出显著影响。
　　 5.在深休眠期对休眠枝条外施H2O2后，没有显著的破眠作用。但外源H2O2改变休眠芽Ca+转运状态。低浓度H2O2降低组织Ca+吸收速率;高浓度H2O2使组织对Ca2+的转运由吸收转变为释放，这种变化与休眠解除前后Ca2+区域分布的变化一致。高浓度H2O2还诱导组织对K+离子的释放速率升高，对Na+离子的吸收速率降低，对Mg2+的吸收速率升高。
　　 6.50℃高温、单氰胺和TDZ对休眠芽呼吸代谢影响不同。在总呼吸速率上，50℃高温处理后芽呼吸速率数小时内都维持在低水平;单氰胺能够直接抑制休眠芽的呼吸作用，抑制程度与浓度呈正比，但处理后1d内芽呼吸速率又显著升高;TDZ对休眠芽呼吸速率没有显著影响。在呼吸代谢电子传递途径上，50℃高温和单氰胺都直接抑制电子传递的CYT途径，对ALT途径没有规律性影响;在底物途径上，高温和单氰胺在处理后1～4 d活化PPP途径，TCA途径在萌芽前活化。TDZ对呼吸途径变化影响较小，仅在处理后第12d表现出对PPP的小幅活化。
　　 7.50℃高温和单氰胺处理后短时间内，芽内激素(GA、ZR、IAA、ABA)含量均出现下降。高温处理后，芽内4种激素含量均在第4d大幅下降，但萌芽时GA、ZR、IAA含量又升高，ABA含量则仍低于对照;单氰胺处理后，除ZR外，芽内其他3种激素含量也出现下降，但幅度小于高温处理。

目录

声明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 自然休眠的进程

1．2 自然休眠的快速解除

1．2．1 高温对休眠的解除作用

1．2．2 单氰胺对休眠的解除作用

1．2．3 TDZ对休眠的解除作用

1．3 自然休眠与细胞周期调控

1．3．1 植物休眠分生组织的细胞周期特点

1．3．2 细胞周期G1／S转换与G2／M转换的调控

1．4 自然休眠与Ca2+的关系

1．4．1 休眠进程中芽分生组织细胞Ca2+空间转移

1．4．2 Ca2+对自然休眠进程的影响

1．4．3 Ca2+参与细胞分裂调控

1．4．4 钙调蛋白与细胞分裂调控

1．4．5 钙调神经磷酸酶与细胞分裂调控

1．4．6 Ca2+信号的跨膜传递

1．5 休眠调控的关键基因

1．5．1 CO／FT基因与休眠调控

1．5．2 CBF基因与休眠调控

1．5．3 DAM基因与休眠调控

1．6 自然休眠与其他主要生理过程的关系

1．6．1 自然休眠与活性氧代谢的关系

1．6．2 自然休眠与呼吸代谢的关系

1．6．3 自然休眠与激素的关系

1．7 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料与处理

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验处理

2．2 试验方法

2．2．1 芽状态检测

2．2．2 细胞周期检测

2．2．3 Ca2+亚细胞定位

2．2．4 H2O2含量测定

2．2．5 CAT、POD活性测定

2．2．6 激素含量测定

2．2．7 Ca2+、H+、Na+、K+、Mg2+转运检测

2．2．8 呼吸代谢测定

2．2．9 RNA提取

2．2．10 反转录

2．2．11 相关基因表达的QRT-PCR检测

2．2．12 数据处理

3 结果与分析

3．1 芽自然休眠的细胞周期特点

3．2 高温、单氰胺和TDZ的破眠作用

3．3 休眠芽分生组织的Ca2+存在状态和破眠剂对Ca2+转运的影响

3．3．1 休眠芽分生组织Ca2+的亚细胞分布

3．2．2 休眠芽的Ca2+转运状态

3．3．3 破眠剂单氰胺和TDZ对休眠芽Ca2+转运的影响

3．3．4 高温、、单氰胺和TDZ对油桃芽CaM表达的影响

3．4 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽H2O2代谢的影响及H2O2对Ca+转运的影响

3．4．1 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽H2O2含量的影响

3．4．2 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽CAT和POD的影响

3．4．3 H2O2的破眠作用

3．4．4 H2O2对休眠芽Ca2+转运的影响

3．4．5 H2O2对休眠芽Na+、K+、Mg2+转运的影响

3．5 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽呼吸代谢的影响

3．5．1 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽总呼吸的影响

3．5．2 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽呼吸代谢电子传递的影响

3．5．3 高温、单氰胺和TDZ对休眠芽呼吸代谢底物途径的影响

3．6 高温和单氰胺对芽内激素含量的影响

3．6．1 高温和单氰胺对芽内GA含量的影响

3．6．2 高温和单氰胺对芽内ZR含量的影响

3．6．3 高温和单氰胺对芽内IAA含量的影响

3．6．4 高温和单氰胺对芽内ABA含量的影响

4 讨论

4．1 休眠解除途径的分类及作用特点

4．2 细胞周期调控与自然休眠

4．3 H2O2／CAT与自然休眠解除

4．3．1 自然休眠解除过程中的H2O2／CAT变化

4．3．2 H2O2／CAT对自然休眠的调控

4．4 呼吸代谢与自然休眠调控

4．4．1 呼吸胁迫与休眠解除

4．4．2 呼吸代谢电子传递与休眠解除

4．4．3 呼吸代谢底物途径与休眠解除

4．5 Ca2+与自然休眠调控

4．5．1 Ca2+存在状态在休眠调控中的作用

4．5．2 休眠芽内的Ca2+信号的诱导

4．6 激素与自然休眠解除

4．7 休眠解除机制中各相关因子相互关系

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况