低温胁迫下番茄PSⅡ捕光天线蛋白基因LeLhcb2的功能分析

摘要

低温是一个严重的环境胁迫因子，它影响作物的生长发育，并导致产量和品质的降低。低温胁迫下植物光合碳同化能力下降，即便是在弱光条件下也会产生过剩光能，致使活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量积累，引起植物光系统Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)的光抑制，甚至光氧化。植物在进化过程中，形成了多种防御机制以适应环境的变化，包括PSⅡ捕光天线蛋白调节光能在两个光系统间的分配，促进过剩光能的耗散，降低ROS的积累，从而保护植物光合机构免受过剩激发能的破坏。因此，探讨低温胁迫下捕光色素蛋白复合体(LHC)蛋白对植物低温抗性的影响具有重要的理论意义和实践价值。
　　本实验从番茄品种中蔬6号叶片中分离到了一个PSⅡ捕光天线蛋白基因LeLhcb2，并以过表达该基因的烟草为材料，研究了过表达LeLhcb2对转基因烟草低温耐性的影响，主要结果如下:
　　(1)根据NCBI查得叶绿素a/b绑定蛋白基因的全长mRNA序列（GenBank注册号:AK246535.1）。利用DNAman软件设计特异引物，RT-PCR的方法获得基因的全长cDNA。该基因全长892bp，开放阅读框798bp，编码266个氨基酸。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析发现该基因属于叶绿素a/b绑定蛋白超家族，具有叶绿素a/b绑定结构域。与拟南芥12个叶绿素a/b绑定蛋白比对结果显示该基因氨基酸序列与拟南芥AtLhcb2同源性最高（约88％）。与GenBank中其它已知植物LHCB2氨基酸序列比对结果显示该基因氨基酸序列与盐芥、衣藻、豌豆、杨树、景天以及卷柏等植物的LHCB2高度同源。DNAman软件聚类分析结果显示，番茄的LHCB2与杨树和景天的LHCB2最为聚类。以上结果显示我们克隆到的基因是番茄PSⅡ捕光天线蛋白基因Lhcb2，我们将其命名为LeLhcb2。
　　(2)拟南芥原生质体瞬时表达p35S-LeLhcb2-GFP融合蛋白，并通过激光共聚焦显微镜观察发现GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合，说明LeLhcb2蛋白定位于叶绿体。
　　(3)半定量PCR和Northern杂交分析表明，LeLhcb2基因在叶片中表达量最高。qRT-PCR和Northern杂交分析表明LeLhcb2的表达受4℃、NaCl诱导，受渗透胁迫和氧化胁迫抑制。此外，LeLhcb2的表达还受到信号物质的影响。
　　(4)成功构建了pET-LeLhcb2原核表达载体，用IPTG诱导LeLhcb2在大肠杆菌BL21中表达，将诱导表达的蛋白纯化后免疫小鼠，制备抗体，测得效价为1∶10000， Western杂交表明，低温和高盐均诱导LeLhcb2在蛋白水平的表达。
　　(5)将LeLhcb2的编码区连入pBI121载体，构建了LeLhcb2的过表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，获得正义转基因烟草植株，并通过PCR、qRT-PCR以及Western杂交的方法检测具有卡那抗性的转基因植株，结果表明成功获得了LeLhcb2过表达的转基因植株。
　　(6)正常生长条件下，野生型与正义转基因植株表型上无明显差别。但是，低温胁迫条件下，转正义基因烟草幼苗的存活率和生长量优于野生型，表现出更高的鲜重和叶绿素含量。低温胁迫下，转基因烟草成苗也表现出更好的生长表型。体现在较高的净光合速率(Pn)和较低的细胞膜受伤害程度。这些结果表明过表达LeLhcb2基因提高了转基因烟草植株的低温耐性。
　　(7)在低温胁迫条件下，转正义烟草植株与野生型相比，表现出较高的Fv/Fm，NPQ和D1蛋白含量，说明转基因烟草PSⅡ的光抑制程度较轻。
　　(8)低温胁迫条件下，转正义基因烟草较野生型能维持较低的O2-和H2O2含量，并且这种较低的ROS积累不是由于在低温条件下转基因烟草具有更高的APX和SOD酶活性引起的。