玉米促分裂原活化蛋白激酶激酶基因ZmMKK1的分离及功能分析

摘要

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径在动植物、酵母中是高度保守的信号转导模型。MAPK级联途径由三种逐级磷酸化的蛋白激酶组成:即促分裂原活化蛋白激酶激酶之激酶（MAPKKK/MKKK/MEKK/MAP3K），促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK/MKK/MEK/MAP2K)，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK/MPK)。MAPK级联途径通过“交谈”形成了复杂的信号传递网络，将不同的细胞膜感受器与细胞应答联系起来，响应生物、非生物胁迫，并在植物激素信号和细胞分裂及生长发育进程中起重要作用。MAPK级联途径基因模型中MAPKK数量少于其他MAPK成员，这表明相同的MAPKK可能在许多个MAPK模型中发挥作用。MAPKKs在整合来自MAPKKKs的信号和传递信号到多个MAPKs中起重要的作用。目前，在拟南芥、烟草、紫花苜蓿等不同物种中已研究了多个MAPKKs的结构及功能。
　　玉米作为一种世界性粮食作物，其生长和产量受到各种生物和非生物胁迫的严重影响。最近研究表明，许多玉米蛋白激酶在抵抗胁迫中起重要的作用。目前已在玉米中分离到3个MAPKKs。ZmMKK3可以调节渗透胁迫;ZmMKK4通过活性氧清除系统调节渗透胁迫并且增强了耐盐和耐冷能力;ZmMEK1与玉米根尖的增殖有关等。本研究从玉米品种郑单958根系中分离到一个A组MAPKK基因，命名为ZmMKK1，对其序列特征、表达模式，以及异源转化拟南芥和烟草，在功能方面做了初步研究，同时建立了同源转化玉米体系。主要结果如下:
　　(1)从玉米根系中分离得到一个促分裂原蛋白激酶激酶基因ZmMKK1，全长为1641bp，并且包含有1053bp的ORF，编码350个氨基酸，预测分子量为38.8 kDa，等电点为6.3。蛋白序列分析表明ZmMKK1具有进化上保守的11个亚结构域，第Ⅶ-Ⅷ亚域中含有保守的S/T-X3-5-S/T基序，并且N端有一个保守的MAPK的锚定位点。进化树分析表明，ZmMKK1属于A族的MAPKK。
　　(2) ZmMKK1及其活化形式ZmMKK1DD与GFP融合后，在洋葱表皮瞬时表达进行亚细胞定位，发现ZmMKK1定位于细胞质，而ZmMKK1DD定位于细胞质和细胞核。
　　(3) qRT-PCR分析发现，ZmMKK1在玉米根、茎、叶中特异性表达，其中在茎中表达最高。NaCl，PEG，12℃，SA，H2O2，CaCl2处理均能诱导ZmMKK1的表达，而ETH，ABA，JA则抑制ZmMKK1的表达。H2O2和Ca2+介导12℃对ZmMKK1的表达调控。
　　(4)将ZmMKK1构建PROKⅡ表达载体，成功转化烟草和拟南芥。qRT-PCR分析表明，ZmMKK1在转基因植株中稳定表达。
　　(5)低温胁迫下，过表达ZmMKK1的转基因烟草种子比转空载体烟草种子萌发率高，转基因烟草幼苗的长势比对照幼苗好。转基因烟草积累较多的相容性物质如脯氨酸、可溶性糖，具有较高的抗氧化酶活性，并且增强了胁迫相关基因的表达。
　　(6)用烟草青枯病原菌和葡萄球菌侵染后，过表达ZmMKK1烟草增强了对细菌病原菌的抗性，但增加了对真菌病原菌的敏感性。
　　(7)高盐和干旱条件下，过表达ZmMKK1拟南芥通过ROS和依赖ABA途径增强了对高盐和干旱胁迫的抗性。
　　(8)构建pYES2-ZmMKK1转化酿酒酵母。在高盐和干旱胁迫下，ZmMKK1增强了酿酒酵母对盐胁迫和干旱胁迫的耐性。
　　(9)酵母双杂交实验表明，ZmMKK1与ZmMEKK1发生互作。
　　(10)构建PZP211-ZmMKK1正反义表达载体，进行同源转化玉米。qRT-PCR分析表明，ZmMKK1在转基因玉米中稳定表达。