二穗短柄草VERNALIZATION1基因功能及其直接下游靶基因分析

摘要

VERNALIZATION1（VRN1）为温带禾本科植物从营养生长进入生殖生长的关键性基因，对小麦的抽穗以及花器官的发育起重要作用。基于麦类植物的基因组相对较大，生长周期较长，遗传转化较困难等特点，目前对麦类植物VRN1基因的研究还比较少。作为温带禾本科中响应春化的关键基因，VRN1在整个开花调控网络中的具体作用，VRN1、VRN2及FT三者在整个开花调控网络中的上下游关系等一系列的分子机理尚未明确。
　　二穗短柄草与大麦、小麦等重要的粮食作物亲缘关系较近，是新型的温带禾本科模式植物。本研究主要以二穗短柄草生态型Bd21为材料。为探索二穗短柄草中VRN1的功能，我们克隆了二穗短柄草BdVRN1 cDNA，分别构建CaMV35S及ZmUbi启动的VRN1过表达载体，并遗传转化野生型二穗短柄草。长日照条件下，强启动子ZmUbi能够导致植物极早开花，95％以上的组培苗在分化阶段即可开花，且有些极早花植株叶片有向穗分化的趋势。与野生型相比，CaMV35S启动BdVRN1过表达转基因植株提前一到两片叶开花。表明VRN1促进植物开花的程度与其表达量有密切关系。外源基因表达量越高，VRN1促进植物开花的效果越明显，表现出的早花表型也越强烈。
　　为进一步探索VRN1的功能，本研究同样做了短日照下ZmUbi启动BdVRN1过表达实验。短日照下过表达BdVRN1同样能导致植物早开花。转基因植株再生过程中，分化培养基上同样会有早花植株出现。鉴于短日照条件下，内源性刀、VRN1等开花促进因子本底水平较低。与长日照相比，转基因植株早花表型稍弱，仅有5％左右的植株会出现刚刚分化即顶着穗长出的极早花表型。实验结果表明无论长短日照下，VRN1都是植物控制开花的关键基因。
　　小麦VRN1m mavp突变体表现为永不开花，为进一步验证二穗短柄草中VRN1的功能，本研究构建了BdVRN1 RNAi载体并遗传转化野生型二穗短柄草。根据不同的沉默效果，BdVRN1 RNAi转基因株系表现出不同程度的晚花表型。开花叶片数在9～15片叶不等。BdVRN1 RNAi沉默实验表现出晚花表型，进一步证明了VRN1的确能够促进植物开花，并进一步确定了其在植物开花调控中的关键作用。
　　长短日照下过表达BdVRN1均能导致植物出现早花表型，但对其早花花器官解剖分析，并未发现无明显异常。这表明，VRN1的下游可能存在影响花器官发育的直接靶基因。为进一步探索控制开花的分子机理，我们检测了转基因植株中开花相关基因的表达量变化。在BdVRN1过表达及RNAi沉默转基因植株中，我们检测的开花相关基因，尤其是FT的两个同源基因，其表达量均无无发生太大变化。这表明，温带禾本科中FT可能位于VRN1的上游起作用，FT通过上调VRN1的表达来促进植物开花。
　　为寻找VRN1的直接下游靶基因，本研究构建了小标签载体。过表达融合蛋白实验表明，只有后端标记的BdVRN1-3xHA载体对VRN1功能影响不大，转基因植株能出现早花表型。前端以及两端标记的小标签载体，过表达都无早花现象，他们影响了VRN1的功能，后续实验不能使用。此外，本研究对雌激素诱导实验也做了探索。实验结果表明，表面喷洒雌激素后8小时取材，目的基因条带最亮，诱导效果较明显。