miRNA骨架内置siRNA干扰J亚群禽白血病病毒复制

摘要

J亚群禽白血病(subgroup J of avian leukosis virus)是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒引起的以髓细胞瘤和其他细胞恶性肿瘤为特征的传染性肿瘤性疾病。J亚群禽白血病病毒（ALV-J）的基因排列顺序从5'端至3'端依次为LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR，主要含有gag、pol、env三个结构基因及结构基因两侧的长末端序列(long terminal repeats，LTR)。
　　近年来，虽然各检测技术有所提高，但因一些条件限制，该病对我国的危害依然很大。由于亚群间各毒株比较相近，但不同遗传特征的病毒引起的不同肿瘤的潜伏期不同，所以目前尚无有效防治J亚群禽白血病的方法;由于ALV-J的垂直传播性、先天感染的免疫耐受鸡是主要的传染源，目前也无可用的疫苗，所以应该另寻方法，靶向于病毒找寻攻克这一难题的方法。
　　RNA干扰(RNA interfrence，RNAi)，是由21 nt～23 nt的双链RNA(Double strandedRNA，dsRNA)引起的同源的内源性mRNA降解，从而导致基因表达沉默的现象，所以为了更好的减轻ALV-J带给养禽业的损失，探索利用RNAi技术去解决这一难题。
　　通过比较ALV-J不同毒株的同源性，针对ALV-J NX0101毒株的gag基因中p15编码区、pol基因中p32编码区、env中gp85编码区及LTR基因中的U3编码区中同源性较高的区域筛选到4对siRNA，设计将siRNA置于miRNA骨架结构中，人工合成，将其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中，构建了miRNA干扰表达质粒，分别命名为:p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR和p-miR-mock（阴性对照），进行单独干扰和联合干扰，将其转染105.2 TCID50 ALV-J(NX0101)感染的DF-1细胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分别在蛋白水平和核酸水平上检测表达质粒抑制ALV-J复制效果。将质粒与病毒腹腔接种1日龄SPF雏鸡，隔日采棉拭子，检测ALV-J p27，对其排毒情况进行监测，每6天采血，分离血清，对其进行抗体检测，分别在2周龄和4周龄时剖杀5只/组，通过血液学检测、大体病变和组织学病变方面评估miRNA干扰表达质粒在体内的抗病毒效果，进而分析其在临床上的使用价值。
　　细胞中抗病毒实验结果表明:(1)4个表达质粒能使靶基因的mRNA和囊膜蛋白的表达水平显著降低，与阴性对照和空载体对照相比，p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR重组表达干扰质粒在DF-1细胞中对ALV-J核酸抑制率分别为:83％、78％、85％、74％;(2) p-miR-LTR与其他三种p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env干扰质粒联合转染接毒细胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分别检测其对ALV-J在DF-1细胞中复制的影响。联合干扰后，p-miR-gag+LTR、p-miR-pol+LTR、p-miR-env+LTR对ALV-J的抑制更有效，核酸抑制率分别为:98％、98％和96％，由此显示，联合干扰对病毒的抑制具有协同作用，可以更显著的抑制病毒的增殖。体内抗病毒结果:(1)对各组鸡棉拭子ALV-J p27检测显示，与ALV-J接毒组和空载体mock组相对比，所有重组质粒干扰组感染初期(1-10d)有效的抑制了病毒的增殖，其S/P值基本都在临界值之下，后期各重组质粒干扰组排毒有升高趋势，但均低于阳性对照组，单独与联合干扰组干扰效果差异不显著;(2)血液学检测显示，干扰组的白细胞数，淋巴细胞数均接近正常值;(3)病理组织学观察发现，ALV-J接毒组的肾脏、肝脏等器官有淋巴细胞增生灶，脑、肺脏出血，法氏囊萎缩，而重组表达干扰质粒组只有部分器官呈现少许的炎性细胞的浸润，联合干扰组大体剖检及病理学检测无明显病变。
　　由此看出本实验所筛选到的4对siRNA在体外细胞和动物体内都具有显著抑制ALV-J复制效果，本研究为ALV-J和其它病毒病提供了一种新的有效的防治和治疗途径。