实时荧光定量PCR技术用于土壤中小麦纹枯病菌的定量检测及动态分析

摘要

小麦纹枯病是由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）引起的土传真菌性病害，是影响小麦高产稳产的重要病害之一，遍布世界各温带小麦种植区。小麦纹枯病在我国主要发生在江淮流域及黄河中下游冬麦区，其中江苏、浙江、安徽、山东、河南、陕西、湖南、湖北及四川等冬小麦主产区发病普遍，其危害呈逐年增长的趋势。小麦纹枯病以菌核或病残体上的菌丝在土壤中越夏和越冬，在小麦的整个生长季节都可以侵染危害。传统的病菌测定方法难以实现对土壤中的小麦纹枯病菌的定量检测。本研究利用real-time PCR技术，成功设计了一对针对小麦纹枯病菌具有特异性的引物，分别于2012、2013年春天（3月3日）开始，以10d作为一个间隔对土壤中小麦纹枯病菌的生物量进行定量检测，得到土壤中小麦纹枯病菌的消长动态曲线。同时利用当地气象站同步监测的气象资料得到田间10d平均有效积温变化曲线及自采样点麦田调查得到的田间小麦纹枯病的病情指数变化曲线，并分析了三者的关系。主要研究结果如下：
　　⑴基于小麦纹枯病菌5.8SrDNA-ITS区的序列，设计了小麦纹枯病菌的特异性引物对WKF-8/WKR-8，采用CTAB法提取小麦纹枯病菌wk-206(R.cerealis AG-D)菌株的DNA，利用常规PCR扩增，产生了大小约200bp的目的片段。以小麦纹枯病菌(R.cerealisAG-D)、棉花立枯病菌（R.solani AG4-HG-Ⅰ，AG4-HG-Ⅲ）、马铃薯黑痣病菌（R.solaniAG3，AG4）、玉米纹枯病菌(R.solani AG4-HG-Ⅲ，AG1-IB)、层出镰孢菌(Fusariumproliferum)、麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）和其他双核类丝核菌标准菌株DNA为模板进一步对所设计的引物的特异性进行检测。电泳结果显示只有以小麦纹枯病菌菌株DNA为模板时可扩增产生目的片段，以其他检测菌株为模板时无目的片段产生，证明引物对WKF-8/WKR-8对小麦纹枯病菌能进行特异性检测。
　　⑵利用设计的特异性引物，将退火温度在58℃～62℃间进行优化，选择58.4℃为最佳退火温度，建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料法的real-time PCR反应体系。利用CTAB法提取小麦纹枯病菌wk-206菌株的DNA，经检测其浓度为2.02×102ng/μl，将该DNA进行稀释后，获得10倍梯度稀释的DNA系列浓度。利用常规PCR技术和实时荧光定量PCR技术分别检测引物的灵敏度，结果显示，常规PCR的检测下限为1.0×10-3ng/μl，实时荧光定量PCR的检测下限为1.0×10-5ng/μl，实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR高100倍。
　　⑶以系列稀释的wk-206菌株的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。扩增结果显示，当模板浓度在1.0×10-1～1.0×103ng/μl之间时呈现良好的线性关系，决定系数为0.995，扩增效率为99.7％，线性范围可达5个数量级。溶解曲线目的产物溶解温度为（83±0.5）℃，产物单一，无引物二聚体产生，符合荧光定量参数的要求范围。证明该标准曲线可以用于土壤中小麦纹枯病菌的定量检测。
　　⑷综合两年土壤中小麦纹枯病菌（R.cerealis）生物量的检测结果表明，土壤中病原菌的生长趋势大致相同，在采样期间病原菌的数量有两个明显的上升高峰，分别在四月中旬和五月下旬，分别对应于小麦生长时期的拔节初期和蜡熟期。两年的检测结果间的差异表现在2012年对土壤中小麦纹枯病菌的生物量高峰出现于4月12日，2013年土壤中小麦纹枯病菌的生物量高峰出现于4月22日。这种差异与同期两年田间10d有效积温存在较大差异有关。
　　⑸综合分析田间调查的小麦纹枯病的病情指数变化曲线和土壤中小麦纹枯病菌生物量的变化曲线可以看出，田间小麦纹枯病病情指数增长快速的时期恰巧对应于土壤中病菌生物量检测出现升高-高峰-下降-第二个高峰的时期，在这个阶段也正是土壤中纹枯病菌循序转移至小麦植株上并进行快速扩展的时期;土壤中小麦纹枯病菌生物量第二个高峰的出现也是小麦纹枯病菌自小麦植株再次转移至土壤中的一个重要标志。土壤中小麦纹枯病菌生物量的变化及田间小麦纹枯病菌病情指数的变化曲线反映了小麦纹枯病菌自土壤-小麦植株-土壤的动态变化趋势。