烟草丛顶病毒复制酶的移码翻译调控和基因组复制的定量研究系统的初创

摘要

烟草丛顶病由幽影病毒属（Umbravirus）成员烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus，TBTV)及黄症病毒科(Luteoviridae)的烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus，TVDV)复合侵染引起。TBTV的基因组是一条(+)ssRNA，由4152个核苷酸组成;推测编码4个蛋白。ORF1编码35kD的蛋白，ORF1的C端与ORF2的N端有8个密码子的重叠，ORF2编码63kD的蛋白。通过同源比对推测ORF2蛋白可能是通过-1位的移码翻译机制得到表达，存在形式为ORF1/ORF2的融合蛋白。
　　本文首先完成了ORF2移码翻译表达机制的定性。PCR扩增TBTV的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中，转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得高效价的抗血清(1∶243000)。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示，TBTV ORF1多克隆抗体既可用于检测田间发病的烟草丛顶病叶样品，也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。其中，在体外翻译系统中，利用所制备的ORF1多克隆抗体，还检测到以ORF1/ORF2融合蛋白形式存在的的表达产物，完成了对ORF2移码翻译机制的定性，移码效率约为1％。然后，尝试创建ORF2移码翻译机制的定量研究体系。将海肾荧光素酶的ORF融合进TBTV的ORF2中，构建了移码机制定量研究的基础载体。以此载体为基础，构建了一系列的突变体（点突变、缺失突变等），对在体外翻译体系和体内翻译体系中移码机制的定量研究进行了初步探索。同时为解释该定量体系中出现的问题，制备了海肾荧光素酶（Rluc）的多克隆抗体，并进行了抗原亲和纯化;目前基本完成ORF2移码翻译机制的定量研究体系的创建，利用ORF1和Rluc的抗体分别检测ORF1和ORF2-Rluc的表达，其比值为移码的效率。为建立基因组复制的定量研究体系，首先通过重叠PCR扩增到ORF1/ORF2融合蛋白序列并克隆到原核表达载体pMAL-C2X中，转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1/ORF2蛋白，经过亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。体外实验表明，该融合蛋白的酶活力较低，基因组复制的定量研究体系的条件有待优化。另外，原核表达并纯化了TBTV的ORF3和ORF4蛋白，为后期研究TBTV编码的蛋白间互作以及蛋白与基因组RNA的互作储备实验材料。