虎杖花对丝光绿蝇毒杀活性成分及致毒机理研究

摘要

丝光绿蝇(Lucilia sericata)，俗称绿豆蝇，能传播痢疾、伤寒、霍乱、结核等多种疾病。在对其进行化学防治过程中常造成食品、环境污染及人体中毒等事故，同时随着化学药剂的长期大量地连续使用，蝇类已对诸多化学杀虫剂产生了抗药性。因此，从天然产物中寻找新的杀虫活性物质是开发绿色新型杀虫剂以减少害虫抗药性的有效途径之一。课题组发现，丝光绿蝇对活体虎杖花具有和天然除虫菊相似的中毒症状，表现为吸引、取食、兴奋、瘫软麻痹（麻醉）、死亡等系列行为。经进一步药化实验，研究发现虎杖花甲醇提取物的乙醚部位和甲醇部位具有较强的毒杀活性同时具有和活体花类似的中毒症状。为此，本文采用生物活性跟踪法对其中的杀虫活性成分进行提取、分离、纯化及结构鉴定，并初步探讨其毒杀作用机制。以期寻找和发现防治丝光绿蝇的天然活性物质和先导化合物，为植物源农药的开发利用提供理论依据和技术支持。
　　1、虎杖花对丝光绿蝇毒杀现象生物学观察
　　本文通过现场和实验深入观察了虎杖对丝光绿蝇成虫具有的特异毒杀现象。在虎杖未开花之前，丝光绿蝇对其没有任何兴趣，但一到虎杖花开花之时，丝光绿蝇就会受到虎杖花气味的吸引陆续从四面八方大量聚集于花头上进行吸食。吸食一段时间后丝光绿蝇进入为兴奋状态，表现为乱飞、乱撞、不断搓动前足、并伴有流涎、抽搐等症状。随着取食时间的延长和取食量的增大，丝光绿蝇逐渐进入抑制状态，表现为行动缓慢、麻醉等中毒症状，最终死亡。活体花对丝光绿蝇的毒力曲线为Y=2.1534X-8.8414，相关系数r=0.9872，其LT50为27.32 h。
　　2、虎杖花对丝光绿蝇引诱物质的化学分析
　　在全面观察了虎杖花对丝光绿蝇特异毒杀现象基础上，应用气相色谱质谱联用仪测定了引诱丝光绿蝇取食的挥发性成分。从虎杖花中鉴定出21个化合物，占总峰面积的99.29％。2-己烯酸甲酯，苯戊酮，4-己烯酸甲酯，顺-3-己烯酸甲酯，2-甲基-6-次甲基-1，7-辛二烯-3-醇等5种物质是虎杖花头香的主要成分，占总挥发性成分的63.23％。从成分的类别来看，酯类成分占总挥发性成分的52.09％，以己烯酸甲酯类衍生物为最多，己烯酸甲酯占总酯类成分的85.66％，其中2-己烯酸甲酯的相对百分含量为24.41％;另外一类挥发性成分为苯戊酮和苯乙酮，含量分别为16.30％和4.33％，占挥发性成分总量的20.63％。
　　3、虎杖花杀虫活性物质的分离
　　为了寻找和明确虎杖花对丝光绿蝇的杀虫活性成分，对虎杖花甲醇提取物的石油醚、乙醚、正丁醇、甲醇和水部位进行杀虫实验。石油醚、乙醚和甲醇部位具有较好的杀虫活性，其LC50分别达到1.31，0.30，0.64 mg/mL。而正丁醇和水提取部位没有检测到杀虫活性。为了进一步探明杀虫活性物质，作者对其中两个杀虫活性较强的乙醚部位和甲醇部位的化学成分进行了分离。从乙醚部位分离得到7个天然产物，从甲醇部位分离得到22个天然产物。其中芦荟大黄素、山奈酚、根皮苷、木犀草素、橙皮素、4-羟基苯乙酮、蔗糖、染料木素、橙皮苷、表儿茶素、1-苯乙基-葡萄糖苷等11个化合物为首次从植物虎杖中分离得到。
　　4、单体化合物的杀虫活性
　　为了寻找真正的杀虫物质和先导化合物，作者对分离得到的大部分天然产物均进行了杀虫活性筛选。研究中发现以芦荟大黄素为代表的蒽醌类化合物具有较好的杀虫活性，从试虫的中毒症状来看和提取物相近。大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚在5h的击倒作用随着试药浓度的增大而增大，但仅芦荟大黄素的击倒率超过50％。丝光绿蝇在用药10h的死亡头数（死亡率）均有较大幅度提升，尤其是大黄酚和芦荟大黄素最为明显，死亡率达到了56.67％和86.67％。大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素的浓度均为3.75 mg/mL时，丝光绿蝇在10 h的死亡率分别为43.33％，20.00％，30.00％，56.67％和86.67％;在20 h的死亡率分别为50.00％，30.00％，53.33％，70.00％和90.00％。丝光绿蝇成虫经大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素给药10 h后，其LC50值分别为3.74，5.90，4.89，3.06，2.44mg/mL。给药20 h后，其LC50值分别为3.36，5.29，3.17，1.90，2.26 mg/mL。
　　5、虎杖花中蒽醌类化合物对丝光绿蝇的毒杀机制
　　杀虫活性实验证明蒽醌类化合物是虎杖花中起到杀虫作用的重要的物质，对丝光绿蝇成虫具有较强的神经毒杀作用。丛试虫的中毒症状推测虎杖花中的蒽醌类化合物可能作用于丝光绿蝇的中枢神经系统。在兴奋期，给药组和活体花相对于对照来说均显示乙酰胆碱酯酶活性降低，即酶比活力降低。大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素和活体花对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为7.03％，8.59％，24.02％，11.13％，32.62％和36.13％。在此时期丝光绿蝇体内的神经递质乙酰胆碱含量快速升高，分别为同期对照组的9.45，8.41，9.24，8.98和3.23倍，这和活体化的趋势一致。丝光绿蝇在兴奋期由于乙酰胆碱酯酶酶活力被抑制而导致乙酰胆碱无法被乙酰胆碱酯酶迅速水解为乙酸和胆碱，这会使得大量乙酰胆碱蓄积而无法有效终止神经信号的传递。这时脑神经细胞处于持续兴奋之中，表现为乱飞、乱撞、不断搓动前足、并伴有流涎、抽搐等症状。随着取食时间的延长，取食量增大，乙酰胆碱酯酶酶活性升高，乙酰胆碱被迅速降解，乙酰胆碱释放不足，导致神经传递受阻，试虫由兴奋期转为抑制期（麻醉期），从而表现为行动缓慢、麻醉等中毒症状。丝光绿蝇进入麻醉期至即将死亡期，行动迟缓，取食量进一步增大，蒽醌化合物对丝光绿蝇体内的乙酰胆碱酯酶表现出快速激活作用。在此时期，大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素处理的乙酰胆碱酯酶酶比活力分别为同期对照组的2.42、2.37、2.53、2.44和4.02倍。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 研究意义

1．2 虎杖的国内外研究进展

1．2．1 虎杖的植物学研究

1．2．2 虎杖的化学成分

1．2．3 虎杖的药理作用

1．3 丝光绿蝇的防治

1．4 研究前景

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 实验仪器

2．4 丝光绿蝇的饲养

2．5 实验方法

2．5．1 虎杖花化学成分的分离

2．5．2 丝光绿蝇成虫毒杀实验

2．5．3 乙酰胆碱酯酶(AChE)的测定方法

2．5．4 乙酰胆碱(Ach)的测定方法

3 结果与分析

3．1 生物学现象观察

3．1．1 虎杖花对丝光绿蝇毒杀现象的生物学观察

3．1．2 虎杖开花时间

3．1．3 虎杖花吸引蝇类昆虫的比例

3．1．4 虎杖花吸引丝光绿蝇的来去时间及温度

3．1．5 活体花杀虫活性

3．2 虎杖花对丝光绿蝇引诱物质的化学分析

3．2．1 GC-MS条件

3．2．2 分析方法

3．2．3 测定结果

3．3 虎杖花粗提物对丝光绿蝇的杀虫活性

3．4 虎杖花杀虫成分的寻找

3．4．1 乙醚部位化学成分的分离

3．4．2 甲醇部位化学成分的分离

3．5 单体化合物的杀虫活性

3．5．1 蒽醌类化合物的杀虫症状

3．5．2 蒽醌类化合物对丝光绿蝇的5 h击倒率

3．5．3 蒽醌类化合物对丝光绿蝇的10 h死亡率

3．5．4 蒽醌类化合物对丝光绿蝇在不同时间条件下的的杀虫活性

3．6 中毒试虫乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱的测定

3．6．1 乙酰胆碱酯酶(AChE)的测定

3．6．2 乙酰胆碱(Ach)的测定

4 讨论

4．1 虎杖花对丝光绿蝇的吸引、毒杀生物学现象

4．2 虎杖花中杀虫物质的寻找

4．3 虎杖花中蒽醌类化合物对丝光绿蝇的作用方式和作用机理

5 结论

5．1 虎杖花对丝光绿蝇毒杀现象生物学观察

5．2 虎杖花对丝光绿蝇引诱物质的化学分析

5．3 虎杖花杀虫活性物质的分离

5．4 单体化合物的杀虫活性

5．5 虎杖花中蒽醌类化合物对丝光绿蝇的毒杀机制

参考文献

致谢

博士期间发表文章

附图