奶山羊乳腺组织差异表达miRNA功能预测及miR-135a对PRLR基因靶向调控研究

摘要

深入了解乳腺发育与泌乳的分子机制对于改善奶的生产能力有重要的指导意义，为找到miRNA在泌乳期乳腺的生长发育及泌乳过程中发挥的基因表达调控作用，本研究根据已有的崂山奶山羊不同泌乳时期miRNA表达谱及奶牛乳腺组织转录本数据，通过聚类分析、靶基因预测及功能注释等数据挖掘和生物信息学分析方法，对其中差异表达的miRNA做了乳腺发育相关的生物学解释。经生物信息学分析后，以崂山奶山羊单克隆乳腺分泌上皮细胞为试验材料，通过载体构建和细胞转染，利用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因系统及Western-blot等方法验证miR-135a与PRLR基因的靶向关系。主要研究结果如下:
　　(1)通过对miRNA在三个时期高通量测序表达谱中表达量的差异分析，在不同泌乳时期筛选到差异表达miRNA共有66个，其表达模式被聚为6类;
　　(2)以奶牛不同泌乳期乳腺组织转录本为基础，经TargetScan6.2软件进行靶基因预测后，共获得62个miRNA调控的候选靶基因813个;
　　(3)通过功能注释，共对804条序列进行了GO注释，其中有8个基因直接注释到乳腺发育功能，分别为PRLR、TGFBR2、ERBB3、PTHLH、TNFRSF11A、SFRP4、SLC12A2和FGF2。共有235个基因注释到152条pathway通路中，与数据库组织表达谱相比较，有9个基因在乳腺组织中显著高表达，分别为PRLR、ABCC1、CSN1S1、CSN2、CSN3、ABP3、PTHLH、TM4SF18和HSP90B1;
　　(4)荧光定量PCR试验结果表明转染pcDNA3.1(+)-miR-135a载体成功过表达miR-135a的细胞中，PRLR的表达量显著低于pcDNA3.1(+)空载体对照组(P＜0.01)，而miR-135a inhibitor转染组PRLR表达量显著高于其对照组(P＜0.01)，结果表明过表达miR-135a使PRLR表达量显著降低，而抑制miR-135a表达可以使PRLR表达量升高;
　　(5)双荧光素酶报告基因系统结果显示共转染pcDNA3.1(+)-miR-135a和pGL3-promotor-PRLR-3'UTR荧光报告基因载体，其荧光素酶活性显著低于PRLR-3'UTR突变型载体的共转染组(P＜0.01)，说明miR-135a可与预测到的PRLR-3'UTR作用位点相结合抑制其表达从而使荧光素酶活性降低。
　　(6) Western blot试验表明过表达miR-135a可以显著降低PRLR蛋白表达量(P＜0.01)，转染不同浓度miR-135a inhibitor后与阴性对照组相比，PRLR蛋白表达量变化不显著(P＞0.05)，但可见转染较高浓度的miR-135a抑制剂后，PRLR蛋白表达量有上升趋势。
　　通过生物信息学的手段，本研究系统的分析了奶山羊泌乳期乳腺中差异表达miRNA的调控功能，经过分子生物学实验技术的验证，确定了在奶山羊乳腺上皮细胞中，miR-135a对PRLR的表达具有直接的靶向负调控作用。