IFN-α佐剂在重组腺病毒/口蹄疫VP1疫苗免疫应答中对Tfh的调节作用

摘要

目的：滤泡辅助性T细胞(Follicular T Helper cells，Tfh cells）是一类新发现的辅助性T细胞亚群.Tfh细胞对生发中心（germinal center，GC）的形成，B细胞发育，抗体类别转换和建立长期体液免疫应答发挥着重要的作用。干扰素-α（interferon-α，IFN-α）作为重组腺病毒疫苗的佐剂具有良好的免疫增强作用，但IFN-a是否通过介导Tfh细胞增强重组疫苗免疫应答，还不清楚。本课题以IFN-α作为口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）重组腺病毒疫苗的佐剂免疫小鼠，通过观察其对Tfh细胞分化、生发中心形成、Tfh细胞转录因子Bcl-6 mRNA表达及血清中Tfh细胞主要细胞因子白细胞介素-21（interleukin-21，IL-21）分泌的影响，探讨IFN-a佐剂在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中对Tfh细胞的免疫调节作用，为进一步研究IFN-a作为佐剂免疫调节的新机制提供理论依据。
　　方法：6周龄BALB/c小鼠，随机分为四组，每组10只，分别为：免疫共表达FMDV VP1和猪IFN-a的重组腺病毒（rAd5VP1-2A-poIFN-a）组，单独表达FMDV VP1的重组腺病毒（rAd5 VP1）和单独表达猪IFN-a的重组腺病毒（rAd5poIFN-a）的联合免疫组；rAd5VP1组和空载腺病毒Ad组作为对照；分别以腹腔注射的方式免疫小鼠，接种量为108TCID50/只。
　　1.在小鼠免疫重组腺病毒疫苗后7d，取脾脏，分离淋巴细胞，通过流式细胞术检测Tfh细胞（CD4+CXCR5+PD-1+）的分化情况；
　　2.在小鼠免疫重组腺病毒疫苗后7d，取脾脏，分离淋巴细胞，通过流式细胞术检测生发中心B细胞（B220+GL-7+）的分化情况；
　　3.在小鼠免疫重组腺病毒疫苗后7d，取脾脏，分离淋巴细胞，提取RNA，通过real-time PCR技术检测Tfh细胞转录因子Bcl-6 mRNA的表达水平；
　　4.在小鼠免疫重组腺病毒疫苗后7d，取脾脏，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片,4μm,经FITC-PNA抗体染色，免疫荧光显微镜技术观察脾脏中GC（PNA+）的形成，经Image J软件分析平均荧光密度数值；
　　5.在小鼠免疫重组腺病毒疫苗后7d，小鼠眼球取血，分离血清，通过ELISA方法检测血清中细胞因子IL-21的表达水平。
　　结果：1、IFN-a能明显促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导Tfh细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示：小鼠免疫重组病毒7d后，rAd5VP1-2A-poIFN-a组CXCR5+/CD4+细胞的比例（2.66%±0.16）和rAd5 VP1+rAd5po IFN-a组CXCR5+/CD4+细胞的比例（2.54%±0.44）明显高于rAd5VP1组（1.29%±0.10），P<0.05；rAd5VP1-2A-poIFN-a组PD1+/CD4+细胞的比例（2.18%±0.38）和rAd5 VP1+rAd5po IFN-a组PD1+/CD4+细胞的比例（2.22%±0.35）明显高于rAd5VP1（1.49%±0.13），P<0.05；rAd5VP1-2A-poIFN-a组CXCR5+PD-1+/CD4+T的比例（2.22%±0.35）和rAd5VP1+rAd5poIFN-a组 CXCR5+PD-1+/CD4+T的比例（2.19%±0.37）明显高于rAd5VP1组（1.49%±0.13），P<0.05。
　　2、IFN-a能明显促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导GC B细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示：小鼠免疫重组病毒7d后，rAd5VP1-2A-poIFN-a组GL-7+/B220+细胞的比例（7.39%±0.38）和rAd5VP1+rAd5poIFN-a组GL-7+/B220+细胞的比例（4.44%±0.35）明显高于rAd5VP1组（2.65%±0.28），P<0.05。
　　3、IFN-a能明显促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导Bcl-6 mRNA水平的表达。小鼠免疫重组病毒7d后，通过Real time PCR检测BCL-6 mRNA表达水平，结果显示：IFN-a能促进实验组Bcl-6 mRNA的表达，与rAd5VP1组表达水平3.42±0.27相比，rAd5VP1-2A-poIFN-a组Bcl-6 mRNA表达水平为10.47±1.54，P<0.001，rAd5VP1+rAd5poIFN-a组Bcl-6 mRNA表达水平为9.647±1.790，P<0.01。
　　4、IFN-a能明显促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导小鼠脾脏生发中心的形成。脾脏石蜡切片经FITC-PNA抗体染色，荧光显微镜观察，结果显示：小鼠免疫重组病毒7d后，IFN-a能促进实验组生发中心（PNA+）的形成，与rAd5VP1组平均荧光密度数值1.39±0.07相比， rAd5 VP1-2A-poIFN-a组平均荧光密度数值为2.41±0.32，P<0.01；rAd5VP1+rAd5poIFN-a组平均荧光密度数值为2.13±0.13，P<0.05。
　　5、IFN-a能明显促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导IL-21的分泌。小鼠免疫重组病毒7d后，通过ELISA试剂盒检测血清中IL-21分泌水平，结果显示：IFN-a能促进实验组血清中IL-21的分泌，与rAd5VP1组IL-21的表达水平63.68±13.15，pg/ml相比，rAd5VP1-2A-poIFN-a组IL-21的表达水平为149.50±32.74，pg/ml，P<0.01；rAd5VP1+rAd5poIFN-a组IL-21的表达水平为130.60±19.80，pg/ml,P<0.05。
　　结论：IFN-a作为口蹄疫重组腺病毒疫苗佐剂，免疫小鼠的第7天，IFN-a能增强重组腺病毒疫苗诱导Tfh细胞的增殖分化、促进生发中心的形成及促进GCB细胞的增殖分化，提高Tfh细胞转录因子Bcl-6 mRNA的表示水平，增强Tfh细胞主要细胞因子IL-21的分泌水平。实验结果证实，IFN-a在口蹄疫重组腺病毒免疫应答中对Tfh细胞的分化增殖发挥重要的免疫促进作用，为IFN-a佐剂在疫苗免疫应答中发挥的免疫调节作用的新机制提供理论依据。

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前言

材料与方法

1研究对象

2主要仪器和试剂

3实验步骤

4 统计学处理

结果

5．1 FCM检测Tfh细胞

5.2FCM检测GC B细胞结果

5.3 Real-time RT-PCR结果

5.4 免疫荧光结果

5.5 ELISA结果

讨论

结论

参考文献

文献综述

The development of the Follicular helper T cells

综述参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文