一株拮抗马铃薯晚疫病菌菌株的分离鉴定及抑菌性初步分析

摘要

由致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.) de Bary引起的马铃薯晚疫病是生产上最重要的农业病害之一，每年造成我国约65-130亿元的经济损失。通过筛选和鉴定对致病疫霉有拮抗作用的菌种资源来防治马铃薯晚疫病，这在生产上具有广阔的应用潜力。
　　地丝菌属真菌Geomyces sp.WZJ是本实验室在培养马铃薯晚疫病菌时偶然发现并分离得到的。通过对峙实验检测其对马铃薯晚疫病菌不同菌株的抑制效率，结果发现该菌株对本实验室保存的13个马铃薯晚疫病菌菌株具有相似的抑制作用，抑制效率在64.4％-78.5％之间。检测其抑菌谱发现，该菌株对辣椒疫霉（P.capsici）、大豆疫霉(P.sojae)和烟草黑胫病菌(P.nicotianae)等卵菌病原也具有良好的拮抗效果，抑制率分别达到68.4％、58.5％、58.7％，而对其它真菌病害抑制效率较差，说明该菌株对疫霉属病原菌具有一定的特异性拮抗作用。
　　通过形态学和分子生物学方法对其进行鉴定，将该菌株鉴定为地丝菌属真菌并命名为Geomyces sp.WZJ。生物学特性研究表明，该菌株在RA、PDA、PSA培养基上均能正常生长，在查氏培养基(Czapek)不能正常生长，菌落直径最小。在PSA培养基产生孢子较多，菌丝生长最快，最适合其生长;该菌株在4-25℃均能生长，最适温度为18℃，适于低温生长;对pH要求不严格，在pH5-12范围内均能生长，最适pH为6。
　　对该菌株进行液体发酵，得到发酵上清液，检测发现，发酵上清液具有良好的抑菌效果，而菌丝体提取物基本无抑菌活性，说明抑菌物质被分泌到胞外起作用。通过生长速率法检测发酵上清液的抑菌效率，结果显示，发酵5d的发酵上清液与黑麦培养基体积比为1∶25时，抑菌效率为35.6％;发酵10d的发酵上清液与黑麦培养基体积比为1∶25时，抑菌效率为93.6％，说明在一定培养时间范围内，随着发酵天数的增高，抑菌物质逐渐增多。测定发酵16d的发酵上清液的“IC50”，结果发现，将发酵上清液稀释176倍时，该上清液对马铃薯晚疫病菌的抑制效率为50％。
　　通过追踪抑菌活性，检测发酵上清液中抑菌物质的基本属性，该抑菌物质具有水溶性，且耐高温。发酵上清液中脂肪类物质和多糖类物质均没有抑菌活性，说明发酵上清液中的抑菌物质不属于脂肪或多糖类物质。
　　试验测试了发酵上清液在离体叶片上对马铃薯晚疫病的防治效果。通过荧光定量PCR检测菌丝生长量发现，对照组（喷洒空白培养基）菌丝生长量为处理组（喷洒发酵上清液）的122倍。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 马铃薯生产概况

1．2 马铃薯晚疫病研究概况

1．2．1 症状

1．2．2 病原

1．2．3 发病规律

1．2．4 防治方法

1．3 致病疫霉拮抗真菌研究概况

1．3．1 拮抗真菌的主要类型

1．3．2 拮抗真菌的抑菌机理

1．4 地丝菌研究概况

1．4．1 地丝菌的分类及分布

1．4．2 地丝菌的生物防治作用

1．5 生物农药

1．5．1 生物农药的含义

1．5．2 生物农药的种类与机理

1．5．3 生物农药的发展过程

1．5．4 微生物源农药

1．6 ITS在真菌分类中的应用

1．7 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 供试材料

2．1．1 菌株及载体

2．1．2 供试真菌及病原菌

2．1．3 马铃薯品种

2．1．4 供试培养基

2．1．5 主要试剂

2．1．6 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 WZJ菌株对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用

2．2．2 WZJ菌株抑菌谱的测定

2．2．3 菌株的鉴定

2．2．4 进化树的构建

2．2．5 WZJ菌株的生物学特性

2．2．6 抑菌物质存在部位的检测(胞内／胞外)

2．2．7 发酵上清液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的影响

2．2．8 抑菌物质的基本属性测定

2．2．9 WZJ菌株代谢产物在离体叶片上对马铃薯晚疫病的防效测定

3 结果与分析

3．1 WZJ菌株对马铃薯晚疫病菌菌丝生长拮抗作用结果

3．2 WZJ菌株抑菌谱的测试结果

3．3 WZJ菌株鉴定结果

3．3．1 形态学鉴定结果

3．3．2 分子生物学鉴定结果

3．3．3 进化树的构建

3．4 WZJ菌株的生物学特性

3．4．1 不同培养基对WZJ菌株菌丝生长的影响结果

3．4．2 温度对WZJ菌株菌丝生长的影响结果

3．4．3 起始pH对WZJ菌株菌丝生长的影响结果

3．5 WZJ菌株活性成分的研究

3．5．1 发酵上清液及菌丝体形态

3．5．2 胞内／胞外物质的抑菌活性测定

3．5．3 不同天数的发酵上清液对马铃薯晚疫病菌抑制作用测试

3．5．4 发酵上清液对马铃薯晚疫病菌“IC50”的测定

3．6 抑菌物质的基本属性测定

3．6．1 抑菌物质的溶解性

3．6．2 抑菌物质的热稳定性

3．6．3 发酵上清液中脂肪类物质活性检测

3．6．4 发酵上清液中多糖类物质活性检测

3．7 离体叶片试验测试发酵上清液对马铃薯晚疫病的防治作用

4 讨论

4．1 WZJ菌株的分类鉴定

4．2 WZJ菌株发酵条件的优化

4．3 WZJ菌株次生代谢产物对马铃薯晚疫病抑菌作用

4．4 WZJ菌株作为生防菌株的应用潜力

5 结论

参考文献

附录

致谢