两株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及遗传演化分析

摘要

猪流感（Swine influenza，SI），是由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一种在猪群常发的急性、热性、传染性呼吸道疾病，其普遍存在于猪群中且根除困难。流感病毒具有较强的宿主选择特异性，自然条件下禽流感病毒和人流感病毒不会发生基因重组，但研究表明两者可以通过猪这一中间宿主来实现重组变异产生新毒株。其原因为:猪体细胞表面同时具有a-2，3半乳糖苷唾液酸受体和a-2，6半乳糖苷唾液酸受体，其中前者对禽流感病毒有较强的亲嗜性，后者对人流感病毒有较强的亲和性，所以猪体可以同时感染人、禽、猪流感病毒，扮演着流感“混合器”的角色。采用血清学监测方法对猪流感的流行与分布情况进行调查，对流行的猪流感病毒毒株进行分离鉴定与遗传演化分析，具有重要的经济学价值和公共卫生学意义。
　　山东位于黄河下游，东临渤海、黄海，与朝鲜半岛、日本列岛隔海相望，且为候鸟迁徙途经路段，候鸟的迁徙扩增了流感病毒的基因库，加上山东是养猪大省，猪流感时有发生，对山东省猪流感病毒进行分离鉴定及遗传演化分析意义重大。本实验以山东作为实验地点，对2013-2014年间送检的山东省各地区的猪血清样本共计1049份，用H1亚型猪流感病毒ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测。检测结果发现:猪流感在春冬两季抗体阳性率高，尤其是两季度中的12月份和3月份，分别为66.63％、55.90％;山东省内的鲁南和鲁西南地区，猪流感的抗体阳性检出率相对较高，分别为56.8％、55.3％，在胶东地区的抗体阳性检出率较低，仅为9.6％。
　　在山东省各地采集猪鼻拭子接10日龄的SPF鸡胚，分别在ZC、NJ两地各分离到一株猪流感病毒毒株，命名为:A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)、A/Swine/N J/03/2014(H1N1)。参照NCBI中已发表序列设计引物，经RT-PCR扩增8片段，胶回收产物与pMD-18T载体连接，连接产物转Trans5a感受态，挑选阳性质粒进行单克隆测序，并对测序结果进行遗传进化分析。两株分离株HA均含有7个糖基化位点，其中5个在HA1，2个在HA2;裂解位点均为QSR/GL，中间没有多个碱性氨基酸的插入，为低致病性的猪流感。两株分离株的HA、M、NA、NP基因与H1N1猪流感病毒的同源性最高，而NS、PA、PB1、PB2基因与H3N2猪流感病毒的同源性最高，推断两株分离株有可能是由H1N1猪流感病毒与H3N2猪流感病毒重组变异而来。
　　分离株A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)在鸡胚上进行传代，并对E20代的病毒测序分析，与原代病毒进行比对，查看变异位点，推断变异趋势，筛选疫苗候选毒株。比对结果显示:截止到E20代，分离株A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)在个别位点发生变异，HA、NP蛋白分别有3个和2个氨基酸变异位点。
　　实验还针对分离到的A/Swine/ZC/90/2014(H1N1)毒株制备了高免血清，采用HI试验和ELISA检测对抗体效价进行监测，结果显示抗体水平在第六周时达到高免血清滴度，若不及时收集抗体水平会有下降的趋势，对制备的高免血清用间接免疫荧光试验进行了验证，荧光信号检测显示制备的高免血清特异性良好。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 流感病毒的分类与命名

1．2 猪流感病毒的形态结构和功能

1．3 流感病毒的变异机制

1．4 猪群中流行的猪流感病毒

1．5 猪流感的诊断技术研究进展

1．6 本课题研究的目的与意义

2 实验

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．1．3 各种溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 山东省送检样品H1亚型猪流感抗体检测

2．2．2 山东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

2．2．3 分离毒株的鸡胚传代分析

2．2．4 高免血清的制备

3 实验结果

3．1 H1亚型猪流感抗体检测结果

3．2 山东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析结果

3．2．1 猪流感病毒的分离结果

3．2．2 猪流感病毒的鉴定结果

3．2．3 猪流感病毒8片段的扩增结果

3．2．4 猪流感病毒8片段序列分析结果

3．2．5 分离株鸡胚传代变异结果分析

3．2．6 高免血清的制备结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

硕士期间已发表文章