布拉氏酵母菌细胞壁高含量β-葡聚糖菌株的构建及功能的研究

摘要

布拉氏酵母菌(S.boulardii)是法国科学家Henri Boulard于1920年从印尼荔枝等水果中分离得到的一种益生酵母菌。目前，布拉菌作为微生态制剂在欧美等国家广泛用于防治旅行者和儿童的各种腹泻。畜牧业上，在饲料中添加布拉氏酵母菌制剂以提高动物的生产性能来提升经济效益已得到包括中国、欧盟在内的世界上许多国家的认可。随着人们对健康和生态环境的高度重视及在畜禽养殖中的进一步研究，布拉菌在畜牧业和医学上必将发挥更大的作用，同时也会有更广阔的应用前景。
　　布拉氏酵母菌作为最具有发展潜力的益生菌，其细胞壁的主要组成成分β-葡聚糖在布拉菌作为益生菌整体的作用中起着关键作用。酵母菌β-葡聚糖是一种具有增强免疫力活性的多糖，占布拉氏酵母菌细胞壁组成的50％以上，因此，布拉菌无疑是β-葡聚糖的重要来源之一。然而，对于β-葡聚糖功能的研究，大都是针对分离纯化的β-葡聚糖进行的。β-葡聚糖作为布拉菌细胞壁的主要组成成分，在布拉菌作为益生菌整体的作用中，不同β-葡聚糖含量与布拉菌的益生功能的影响却未见研究和报道。
　　因此，本研究主要是通过Cre-loxP基因敲除系统对目标基因进行基因敲除，构建一个布拉菌细胞壁高含量β-葡聚糖的变异菌株，可丰富β-葡聚糖的自然资源，为工业上大量提取β-葡聚糖提供了原材料。同时，研究敲除目标基因后对布拉菌表型的影响，并通过体外及动物实验研究β-葡聚糖在布拉菌作为益生菌的益生功能中的作用，以及布拉菌细胞壁β-葡聚糖含量的变化对其益生功能、非特异性免疫能力、抗感染能力及生产性能的影响，探讨布拉菌在分子水平上的作用机理，为进一步改善其益生特性打下基础和提供技术支持。
　　本研究根据研究的目的和意义选出1个可明显影响布拉氏酵母菌细胞壁β-葡聚糖含量的基因THP1，通过实验室构建的适合布拉菌的Cre-loxP基因敲除系统成功筛选出布拉菌细胞壁高含量β-葡聚糖的变异菌株Sb-thp1。对杂合子菌株、变异株的表型进行研究发现，和野生型布拉菌相比，变异株的生长速度减慢，细胞形态变圆变大，而杂合子菌株无明显变化;杂合子菌株、变异株细胞壁对刚果红、NaCl、SDS的敏感性无明显变化，但细胞壁β-葡聚糖的含量明显升高，这丰富了β-葡聚糖的自然资源。动物实验结果表明，布拉菌细胞壁高含量β-葡聚糖变异株和野生型布拉菌相比没有显著提高试验动物的生产性能，其增重效果不明显;对试验动物免疫器官的生长没有明显的促进作用，但变异株组的试验动物的脾脏指数最高;布拉菌THP1缺失变异株有一定的抗大肠杆菌感染的能力，能降低试验动物的死亡率。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 布拉氏酵母菌概述

1．1．1 布拉氏酵母菌的分类

1．1．2 布拉氏酵母菌的益生性

1．1．3 布拉氏酵母菌益生作用的机制

1．1．4 应用

1．2 β-葡聚糖概述

1．2．1 β-葡聚糖结构

1．2．2 β-葡聚糖的制备和检测

1．2．3 β-葡聚糖功能

1．2．4 β-葡聚糖应用领域

1．3 基因敲除技术概述

1．3．1 噬菌体重组酶系统

1．3．2 基因敲除技术的应用

1．4 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种和质粒

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 酶与主要试剂

2．2 方法

2．2．1 引物设计与合成

2．2．2 PZC1质粒的提取

2．2．3 布拉氏酵母菌基因组DNA的提取

2．2．4 THP1基因缺失株的筛选

2．2．5 THP1基因缺失株生长曲线的测定

2．2．6 THP1基因缺失株细胞形态、大小

2．2．7 细胞壁敏感性的测定

2．2．8 β-葡聚糖的含量测定

2．2．9 动物试验筛选

3 结果与分析

3．1 布拉氏酵母菌THP1缺失株的构建

3．1．1 第一个THP1等位基因的敲除

3．1．2 筛选标记的删除

3．1．3 第二个THP1等位基因的敲除

3．2 布拉氏酵母菌THP1基因缺失株表型的研究

3．2．1 THP1基因缺失株生长速度的测定

3．2．2 THP1基因缺失株细胞形态大小的研究

3．2．3 THP1基因缺失株细胞壁敏感性的测定

3．3 THP1基因缺失株细胞壁β-葡聚糖含量的测定

3．4 动物试验鉴定THP1基因缺失株的功能

3．4．1 益生性试验

3．4．2 抗大肠杆菌感染试验

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢