槐花多糖对水貂肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗的免疫增强效果的研究

摘要

肺炎克雷伯氏菌是一种条件致病菌，过去人们认为其对畜禽的危害不大，故一直未引起人们足够的重视。但是近年来关于肺炎克雷伯氏菌引起水貂等毛皮动物疾病的报道却在迅速增加，加之各种抗菌药物的广泛使用，导致该菌的耐药性越来越强，且多重耐药菌株大量出现，肺炎克雷伯氏菌病在水貂等毛皮动物养殖业中的危害越来越严重，因此随着环境的改变，肺炎克雷伯氏菌作为人畜共患传染病的病原，应引起大家的广泛重视。由于目前市场上尚没有有效的肺炎克雷伯氏菌疫苗用于该病的防治，致使该病得不到合理有效的防治，严重制约着水貂等毛皮动物养殖业的发展。因此本研究拟以槐花多糖、弗氏佐剂等为免疫佐剂，制备了不同佐剂的肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗，为肺炎克雷伯氏菌的免疫防控提供新的技术支撑及理论依据。
　　1.山东部分地区水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定
　　为确诊近两年造成水貂死亡的主要细菌性病原，本研究在流行病学调查的基础上，对新鲜病死水貂进行临床症状观察、病理学检查，同时取病变组织肝、肺、气管为材料分离纯化细菌，对所分离的细菌进行形态特征、理化特性检查、药敏试验和16S rRNA基因的分子鉴定。结果显示，从剖检病死水貂的肺、肝、气管组织等均检出同种细菌，生化特性相似，分离菌株对头孢曲松钠和阿米卡星敏感，综合分析，该分离菌株为克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯氏菌。
　　2.槐花多糖对肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗免疫增强效果的研究
　　依照本实验室改进的水提醇沉法提取槐花多糖，并将甲醛灭活的肺炎克雷伯氏菌与槐花多糖或弗氏不完全佐剂等体积配比制备疫苗。将160只清洁级昆明小白鼠（雌性）随机分为4组，于3、7、12天时，每组每只小白鼠分别注射等量的槐花多糖佐剂肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗、弗氏佐剂肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗、全菌体灭活疫苗和PBS。在首次免疫后的第7、14、21、28、35、42、49天每组随机选取3只小白鼠采血检测其血清抗体效价、白细胞介素-2（IL-2）含量、白细胞介素-4（IL-4）含量，外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量水平。同时，在首次免疫后的14天每组随机选取20只进行攻毒保护试验，连续7天记录小白鼠生存状态并统计免疫保护率。结果显示，肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗能够刺激机体产生特异性抗体、提高细胞因子分泌量和外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞数，并为小白鼠提供50％的免疫保护。另外，槐花多糖和弗氏佐剂能够显著提高小白鼠体液免疫和细胞免疫水平且槐花多糖效果更优（P<0.05）。

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1. 肺炎克雷伯氏菌的研究进展

1.1 病原特征

1.1.2 致病机制

1.1.3 临诊症状及病理变化

1.1.4 耐药性研究

1.1.5 预防措施

1.2 疫苗佐剂的研究现状

1.2.1 中药免疫增强剂

1.2.2 多糖佐剂

1.3 本研究的目的和意义

2. 材料与方法

2.1 试剂和仪器

2.2 山东部分地区水貂肺炎克雷伯氏菌分离鉴定

2.2.1流行病学调查

2.2.2细菌分离培养

2.2.3细菌生化鉴定

2.2.4药敏试验

2.2.5分离株16S rRNA基因序列测定

2.3 槐花多糖对水貂肺炎克雷伯氏菌疫苗的免疫增强效果

2.3.1 槐花多糖的提取

2.3.2 水貂肺炎克雷伯氏菌灭活疫苗的制备

2.3.3 动物试验

2.3.4 血清抗体效价的测定

2.3.5 血清IL-4、IL-2浓度的检测

2.3.6 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量的检测

2.3.7 免疫保护试验

2.3.8 数据分析

3. 结果与分析

3.1 山东部分地区水貂肺炎克雷伯氏菌分离鉴定

3.1.1 流行病学调查及病理剖检变化

3.1.2 肺炎克雷伯氏菌分离、纯化和形态观察

3.1.3 生化试验结果

3.1.4 药敏试验结果

3.1.5分离株16S rRNA基因序列的测序

3.2槐花多糖对肺炎克雷伯氏菌疫苗的免疫增强作用

3.2.1 血清抗体效价

3.2.2 血清IL-2浓度

3.2.3 血清IL-4浓度

3.2.4 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量的检测

3.2 免疫保护试验

4. 讨论

结 论

参考文献

致谢

攻读在职硕士学位期间发表论文

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