蓝莓根际促生细菌的筛选、鉴定及其促生效果

摘要

蓝莓是重要经济作物，近年来，在山东、辽宁等北方地区种植面积不断扩大。由于蓝莓根系不发达、吸收养分能力差，喜好偏酸土壤环境、适宜土壤pH为4.5-5.5，制约了蓝莓生产。植物根际促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR）具有促进植物根系生长发育、调控和改善根际土壤环境、防治土传病害等多种作用。本研究从蓝莓根际筛选生长素产生菌、蛋白酶产生菌、产酸菌及溶磷细菌等，并进行鉴定；通过营养钵苗和穴盘苗盆栽试验验证其促生效果；运用高通量测序技术探究BIA070和BPR176菌株对根际土壤微生物群落结构的影响；对BIA070菌株进行GFP标记，探究其根际定殖能力；研究产酸菌对土壤pH的影响。为蓝莓专用PGPR微生物肥料研制与推广应用奠定基础。
　　从蓝莓根际筛选到生长素产生菌14株、蛋白酶产生菌12株、溶磷细菌6株。通过穴盘苗试验和营养钵苗试验，初步确定了10株促生效果较好的菌株，鉴定结果显示：BIA032属于Leucobacter aridicollis，BIA044、BIA088、BPR082、BPR088、BPR176属于阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），BIA070、BIA141属于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），BPR142属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），BIP191属于分散泛菌（Pantoea dispersa）。
　　盆栽条件下，BIA032、BIA044、BIA088、BIA141、BPR082、BPR142、BIP191菌株能促进蓝莓营养钵苗地径和株高增加；BPR088、BIA070、BPR176促进了蓝莓穴盘苗的生长，与对照相比，植株株高和地上部干重都达到显著性差异，株高分别增加了61.23％、38.92%、35.05%，地上部干重分别增加了92.65%、64.13%、47.58%；BPR088、BPR176还显著增加了蓝莓的地径，分别增加了24.58%、17.47%，BIA070也促进了蓝莓地径的增长，但没有达到显著性差异；BPR176处理的植株叶片叶绿素含量同对照相比增加了25%，达到显著性差异；BIA070和BPR088降低了叶片丙二醛含量，提高了过氧化物酶活性，提高了蓝莓植株抗逆性。
　　通过营养钵苗试验，进一步验证上述10个菌株的促生效果。试验结果表明，BIA032、BIA070、BIA141、BPR088、BPR176菌株的促生效果明显。与对照相比，显著促进蓝莓地径生长，分别增加了22.16%、36.22%、21.70%、18.29%、22.06%；提高了地上部鲜重和干重，地上部干重分别增加了38.89%、35.19%、37.04%、14.18%、29.63%，除BPR088外，其它4个菌株都达到了显著性差异；在一定程度上促进了株高和叶片数的增加。与对照相比，供试菌株处理增加了植株全氮含量，其中BPR176增加了23.82%，达到显著性差异；土壤碱解氮、速效磷和有机质含量均有不同程度提高，土壤酸性磷酸酶、蛋白酶以及蔗糖酶活性均有所提高。
　　高通量测序结果表明，蓝莓根际土壤细菌群落优势门为变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门，真菌群落优势门为子囊菌门和担子菌门；BIA070和 BPR176两株菌都改变了蓝莓根际土壤的细菌和真菌群落结构。
　　将BIA070进行GFP标记，得到标记菌株 BIA070（gfp），质粒稳定性测定结果表明gfp基因能够在BIA070中稳定表达。通过盆栽试验验证，BIA070（gfp）能在蓝莓根际定殖。
　　从蓝莓根际分离到12株产酸能力较强的菌株，其中11株细菌，1株酵母菌。分类鉴定结果显示：BAC006、BAC011、BAC062属于产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）， BAC025、BAC031、BAC049、BAC064属于大肠杆菌（E.coli），BAC007、BAC041属于柠檬酸杆菌属（Citrobacter sp.），BAC067属于阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）， BAC068属于雷金斯堡预研菌（Yokenella regensburgei），BAC089属于热带假丝酵母（Candida tropicalis）。
　　HPLC测定结果显示：细菌产酸种类主要为草酸、乙酸、柠檬酸，BAC006发酵液中主要为草酸，浓度达到1393.316μg/mL，BAC007、BAC031、BAC067、BAC068乙酸产量较高，浓度分别为9741.763μg/mL、18557.486μg/mL、7731.176μg/mL、9008.221μg/mL；热带假丝酵母产酸种类主要为酒石酸、乙酸、琥珀酸，琥珀酸产量最高，达到43055.475μg/mL。通过土壤培养试验确定BAC068和BAC089能够在蓝莓土壤中维持稳定的存活量，在一定程度上降低了土壤的pH，起到了酸度调节作用。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1 研究背景

1.1.1 蓝莓产业发展现状

1.1.2 蓝莓栽培中存在的问题

1.2 植物根际促生菌在蓝莓土壤改良中的应用前景

1.2.1 微生物在蓝莓中的应用研究进展

1.2.2 植物根际促生菌（PGPR）

1.3 土壤肥力

1.3.1 土壤酶

1.3.2 土壤养分

1.3.3 土壤微生物群落结构

1.4 本研究的立项依据、研究内容和技术路线

1.4.1 立项依据

1.4.2 研究内容

1.4.3 技术路线

2 材料与方法

2.1 主要仪器

2.2 培养基

2.2.1 菌株发酵、培养基本培养基

2.2.2 生长素产生菌筛选培养基

2.2.3 溶磷菌筛选培养基

2.2.4 蛋白酶产生菌筛选培养基

2.2.5 产酸菌筛选培养基

2.3 方法

2.3.2 生长素产生菌的筛选

2.3.3 溶磷菌的筛选

2.3.4 蛋白酶产生菌的筛选

2.3.5 根际促生菌菌种鉴定

2.3.6 蓝莓根际促生菌促生效果验证

2.3.7 促生菌对根际土壤微生物群落结构的影响

2.3.8 促生菌根际定殖能力研究

2.3.9 蓝莓根际产酸菌的筛选

3 结果与分析

3.1 蓝莓根际促生菌的筛选

3.1.1 生长素产生菌

3.1.2 溶磷菌

3.1.3 蛋白酶产生菌

3.2 蓝莓根际促生菌菌种鉴定

3.2.1 菌体及菌落形态

3.2.2 促生菌生理生化特征

3.2.3 16S rDNA基因序列分析

3.3 蓝莓根际促生菌促生效果

3.3.1 蓝莓营养钵苗试验调查

3.3.2穴盘苗试验调查

3.3.3 第二次营养钵苗试验结果

3.4 促生菌对蓝莓根际土壤微生物群落结构的影响

3.4.1 细菌群落结构分析

3.4.2 真菌群落结构分析

3.5 蓝莓根际促生菌BIA070的根际定殖能力研究

3.6 蓝莓根际产酸菌筛选

3.6.1 初筛

3.6.2 发酵液pH测定

3.6.3 菌种鉴定

3.6.4 发酵液有机酸种类及含量

3.6.5 产酸菌土壤培养

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况