基于噬菌体模拟表位的有机磷农药多残留免疫检测方法的研究

摘要

有机磷农药是一类具有广谱杀虫特性和较低稳定性的农药，已被广泛应用于农业生产中。但是，有机磷农药会抑制胆碱酯酶的活性，过度或不合理的使用会对人类健康构成威胁，因此，建立一种快速、简单、准确的检测环境和食物中有机磷农药残留的分析方法是十分必要的。酶联免疫吸附测定（ELISA）具有检测成本低、检测速度快并且可以同时检测多个样品的优势，被广泛地应用于有机磷农药残留检测。
　　本实验室前期制备的有机磷农药宽谱单克隆抗体3A7具有较好的宽谱特异性，但是仍存在灵敏度不足的问题。为了进一步提高检测的灵敏度，本研究采用噬菌体展示技术筛选有机磷农药的抗原模拟表位，并建立了更加灵敏的基于噬菌体模拟表位的免疫分析方法。主要研究结果如下：
　　（1）本研究以有机磷农药宽谱特异性单克隆抗体3A7为靶标，同时使用噬菌体随机展示线性七肽库、线性十二肽库和环七肽库混合肽库，经过四轮生物淘选成功地将噬菌体进行了富集，回收率从1.2×10-7提高到了1.1×10-2。挑取179个噬菌体单克隆用于间接竞争ELISA检测，在250ng/mL对硫磷存在下，有竞争作用的有91个，挑取效果较好的14个单克隆进行测序。测序结果表明，筛选到了5种有机磷农药模拟表位，包括1种线性七肽模拟表位和4种线性十二肽模拟表位。
　　（2）为了使建立的P-ELISA具有更高的灵敏度，以Amax/IC50的比值为标准选择了噬菌体肽21为最佳的噬菌体抗原。通过对甲醇浓度、脱脂奶粉浓度、pH和离子强度的优化，确定了噬菌体肽21使用的最优条件为pH6.5，5×PBS，2.5％甲醇和0.4%脱脂奶粉。
　　（3）在最优检测条件下，建立的P-ELISA对多种有机磷农药具有交叉反应，尤其是对8种O,O-二乙基类和6种O,O-二甲基类有机磷农药具有较强的交叉反应，对这14种农药的IC50值在5.24-63.25ng/mL之间，平均IC50值为37.04ng/mL，变异系数为42.98%。与化学合成包被原建立的异源 ELISA相比，P-ELISA对有机磷农药的灵敏度都有所提高，对倍硫磷的灵敏度提高了3倍以上，除对甲基毒死蜱和乙基嘧啶磷的灵敏度提高2倍外，对其余17种有机磷农药的灵敏度均提高了1倍左右。
　　（4）样品的添加回收实验结果显示，对硫磷、倍硫磷、二嗪农和杀螟硫磷在黄瓜、生菜、苹果和西瓜样品中的添加回收率在82.03-103.63%之间，变异系数在2.31-13.80%之间，说明建立的 P-ELISA检测方法适用于蔬菜和水果等样品中的有机磷农药残留检测。
　　总之，噬菌体具有无毒、易扩增、灵敏度高和使用方便等优势，可以作为化学合成抗原的替代品用于建立异源竞争分析方法。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1 有机磷农药残留现状

1.2 有机磷农药残留的危害

1.3 有机磷农药残留检测技术应用现状

1.4 有机磷农药残留ELISA分析的国内外研究进展

1.5 噬菌体展示技术

1.6 农药残留的提取净化技术

1.7 研究目的及意义

1.8 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 噬菌体肽库的淘选结果

3.2 噬菌体多克隆的检测

3.3 噬菌体单克隆的检测

3.4 噬菌体DNA的测序及序列分析

3.5 噬菌体酶联免疫分析条件的优化

3.6 P-ELISA对20种有机磷农药的交叉反应

3.7 添加回收率测定

4 讨论

（1）噬菌体随机肽库的选择

（2）噬菌体展示库筛选条件的选择

（3）P-ELISA检测方法的建立

（4）样品的萃取净化

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况