纳米壳聚糖-RNA干扰重组质粒复合物体内抑制J亚群禽白血病病毒复制

摘要

J亚群禽白血病是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J)引起的以髓细胞瘤和其他细胞恶性肿瘤为特征的传染性肿瘤性疾病。自1988年从鸡中首次分离以来，ALV-J在世界各地鸡群广泛流行。特别是2009年以来，ALV-J在我国一些蛋鸡群中暴发，发病率高达60％，致鸡死亡率超过30%，该病对我国造成的危害很大。由于亚群间各毒株比较相近，但不同遗传特征的病毒引起的不同肿瘤的潜伏期不同，所以目前尚无有效防治 J亚群禽白血病的方法；由于ALV-J的垂直传播性、先天感染的免疫耐受鸡是主要的传染源，目前也无可用的疫苗，当前控制J亚群禽白血病的有效措施是净化淘汰为主，因此，RNAi小分子核酸药物在无疫苗的禽白血病病毒防治中具有广阔的前景。本实验室前期针对ALV-J NX0101毒株的env基因中gp85编码区筛选到了siRNA，将筛选到的siRNA置于miRNA骨架结构中，人工合成，再将其克隆到 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中，构建了p-miR-env干扰表达质粒，体外实验证实p-miR-env干扰表达质粒可有效抑制ALV-J的复制，但其在体内也是否具有相似的抑制效果？这一问题将在本课题中解决。
　　到目前为止，RNAi的导入系统有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体虽然体外转染效率高，体内作用时间长。但其存在很严重的安全问题，且目的基因容量小，制备复杂，成本高，不能体内反复使用，所以在临床应用上受到了很大的限制。而以纳米粒子复合体等的非病毒基因传递系统，在保持一定转染效率的同时，对其加以修饰，增加体内作用时间，就可以避开临床安全性障碍，加速siRNA药物进入临床治疗。壳聚糖作为唯一天然存在的正电性高分子聚糖，它还具有细胞毒性低、无免疫原性等优点，在体内酶存在下也稳定，可保护所结合基因，又可根据需要程序性降解，且降解产物无副作用。另外，由于动物细胞的平均直径约为10μm，其细胞核的大小通常要小10倍以上，因此，大体积的外来基因载体复合物细胞导入率低，理想的复合物体积应控制在纳米级。根据壳聚糖分子量，脱乙酰基程度以及壳聚糖与基因的用量比等因素可将壳聚糖基因复合体的尺寸控制在100纳米左右，从而顺畅进入动物细胞。此外，在生理条件下其他非病毒类载体会与血清蛋白作用，导致基因传导效率大大下降，而壳聚糖在血清或体液环境中却保留了很高的基因传导效率。因此，纳米壳聚糖在基因递送系统中的应用备受推崇。
　　鉴于壳聚糖所具有的良好的生物相容性、生物降解性，我们选择实验室筛选到的抑制ALV-J囊膜蛋白基因的p-miR-env重组干扰表达质粒作为干扰靶位点，通过纳米技术制备壳聚糖纳米粒，包被重组质粒，使p-miR-env缓慢释放，并能有效的转染CEF细胞,抑制病毒复制，有望成为控制ALV-J一种新手段。
　　利用本实验室前期制备的P-miR-env重组质粒进行转化，大量制备去内毒素质粒，采用复凝聚法制备CTS-P-miR-env纳米粒。通过透射电镜负染观察纳米粒的形态及大小；粒径分析测量仪测定纳米粒的粒径；微量紫外分光光度计测定CTS-p-miR-en v上清中的游离质粒的含量，计算包封率；凝胶电泳法测定纳米粒的稳定性；凝胶电泳法分析纳米粒在胎牛血清中的稳定性。通过体内试验研究CTS-P-miR-env纳米粒在体内抑制ALV-J效果，利用制备好的CTS-p-miR-env纳米制剂进行动物实验，SPF雏鸡分为8组，其中1组为空白对照组；2组为接毒对照组；3组为阴性对照组；4组为CTS-p-miR-env纳米制剂组；5组为裸质粒对照组；6组为CTS-p-miR-env纳米制剂低剂量组；7组为CTS-p-miR-env纳米制剂中剂量组；8组为CTS-p-miR-env纳米制剂高剂量组；采棉拭子检测ALV-J p27，对其排毒情况进行监测；通过体重称量对比、血液学检测、大体病变观察和组织学病变观察等评估CTS-p-miR-env纳米制剂在体内的抗ALV-J效果。
　　CTS-P-miR-env纳米粒制备结果：（1）成功制备了CTS-p-miR-env纳米粒，经电镜观察发现纳米粒呈球形，形状一致；（2）粒径分析测量仪测定其90%粒径为102nm，平均粒径为88nm；（3）包封率为86%；（4）电泳结果表明CTS-p-miR-env纳米粒性质稳定，能够阻止胎牛血清中Rnase对siRNA的降解，具有保护 siRNA的作用。由此可见离子凝胶法可制备粒度分布均匀，形态规则，具有较高包封率的CTS-p-miR-env纳米粒。CTS-p-miR-env纳米粒对siRNA具有酶解保护作用，适合作为基因递送载体。
　　体内实验结果：（1）p27实验结果可以看出接毒组均呈抗原阳性，空白对照组均呈阴性，裸DNA接毒组在20日龄和24日龄出现排毒，纳米制剂中剂量接毒组在28日龄出现排毒，纳米制剂高剂量接毒组未出现排毒，S/P值一直较低；（2）在本实验过程中，ALV-J接毒组白细胞数减少，说明鸡在接毒后病毒对骨髓造血体统产生的危害作用，导致鸡的造血机能下降，从而使白细胞的总数减少，白细胞数量的减少趋势与淋巴细胞百比例的下降趋势相似。裸DNA接毒对照组以及纳米制剂接毒对照组白细胞数量明显高于接毒组，说明其对骨髓的起到保护作用；同时我们也发现纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量白细胞数量依次增高，而且均高于裸DNA接毒组，说明纳米制剂对机体的保护作用强于裸质粒；（3）大体剖检病变观察可以看出接毒组心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊出现明显萎缩，纳米制剂接毒组由低剂量到高剂量心脏、脾脏、肝脏、胸腺、法氏囊逐渐趋于正常，而且相比裸质粒组效果更好；（4）通过病理组织学观察可以看出，接毒组心肌明显出血、形成淋巴细胞炎性灶；肝脏出现大量淋巴细胞炎性灶；肾脏出血；肺脏充血，间质增宽；脾脏淋巴细胞流失，数量明显减少。空白对照组各组织均正常。裸质粒组与纳米制剂低剂量接毒组出现轻微病变，纳米制剂中剂量与高剂量接毒组跟正常对照组相似。
　　由此看出本实验成功制备的CTS-P-miR-env纳米粒分布均匀，形态规则，具有较高包封率，对siRNA具有酶解保护作用，可有效传递P-miR-env。通过体内实验CTS-P-miR-env具有抑制ALV-J复制作用，而且纳米制剂抑制白血病病毒复制作用优于裸质粒。本研究解决了siRNA稳定性差、粒径小、不易进入靶细胞等问题，为ALV-J和其它病毒病提供了一种新的有效防治途径。

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中文摘要

英文摘要

1前 言

1.1 J亚群禽白血病及其防治研究进展

1.1.1 J亚群禽白血病病毒

1.1.2 J亚群禽白血病的预防与治疗

1.2 基于RNAi技术的核酸药物及其传递系统研究进展

1.2.1 RNAi核酸药物作用机制

1.2.2 RNAi药物体内传递系统

1.3纳米壳聚糖作为RNAi药物载体综述

2材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 质粒、细菌和病毒

2.1.2 壳聚糖

2.1.3主要实验试剂

2.1.4主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1 P-miR-env重组质粒的转化

2.2.2 P-miR-env重组质粒去内毒素大提

2.2.3空白CTS纳米粒的制备

2.2.4载P-miR-env重组质粒CTS纳米粒的制备

2.2.5纳米粒形态学观察及粒径分布、粒径的测定

2.2.6纳米粒包封率的测定

2.2.7纳米粒结合性测定

2.2.8纳米粒对抗DnaseI保护测定

2.2.9纳米粒冻干粉的制备

2.3 纳米制剂对鸡感染J亚群白血病病毒体内实验研究

2.3.1 实验动物接种ALV-J病毒和CTS-p-miR-env纳米制剂以及临床症状观察

2.3.2排毒监测

2.3.3血液学指标

2.3.4 大体剖检病变观察

2.3.5组织病理学观察

2.4统计学方法

3结果与分析

3.1载P-miR-env重组质粒CTS纳米粒的表征

3.1.1 透射电镜法测定纳米粒粒径

3.1.2粒径测量仪测定纳米粒粒径

3.1.3包封率

3.1.4结合性

3.1.5对抗DnaseI保护测定

3.1.6冻干粉物理性质

3.2 纳米粒体内实验研究结果

3.2.1 临床症状

3.2.2 排毒监测

3.2.3血液学指标

3.2.4大体剖检病变

3.2.5 组织病理学症状

4.讨论

5.结论

参考文献

研究生期间论文发表情况

致谢