小麦赤霉病Ⅱ型抗性机理研究及相关基因的功能鉴定

摘要

小麦赤霉病抗源极其有限，抗性种质以II型（抗延展型）抗性为主。虽然前人对其抗病机理研究已经开展了大量工作，但是由于其本身的复杂性，目前对小麦赤霉病II型抗性的分子机制和调控网络尚不清楚。本研究以最具代表性的赤霉病II型抗性小麦品种苏麦3号为研究材料，首先对禾谷镰刀菌侵染小穗不同阶段取材进行转录组数据测定，并以此为研究基础，分析赤霉病II型抗性的抗病机理，发掘抗病相关的抗病路径，并结合分子生物学实验对其关键调控基因进行验证。主要研究内容如下：
　　1.接菌处理后0h、12h、24h、48h、72h和96h，分别取接菌穗及相邻穗轴进行RNA提取及cDNA文库构建，并通过Illumina HiSeq2000测序平台进行测序。利用中国春的基因注释文件作为参考基因组，使用Hisat、Htseq和DEseq等分析软件对转录组数据进行两两比较，寻找禾谷镰刀菌处理不同时间后的差异表达基因。以Pval<0.05作为显著差异表达评价标准，发现处理不同时间材料之间的差异表达基因平均有2287个，而且不同时间点的差异表达基因的数目存在很大差异。通过GO注释与富集、KEGG分析以及Mapman对差异基因进行可视化处理。发现小麦在受到禾谷镰刀菌侵染后，细胞壁合成修饰及降解、光合作用、磷酸化、糖代谢途径、激素代谢和信号传导以及去毒化过程的一些基因受到显著调控。其中SA和JA激素合成及信号传导途径分别在禾谷镰刀菌侵染前期和后期受到显著调控，对其信号传导通路上关键基因进行表达分析发现，SA和JA均对小麦赤霉病产生响应，但是SA主要在禾谷镰刀菌侵染0-24h产生响应，而JA对赤霉病的响应时间晚于SA。
　　2.为了验证SA和JA信号通路参与赤霉病抗病过程，本实验对小麦穗部和叶片分别进行了外源激素处理。结果发现，外源施加SA和MeJA可以提高小麦穗部赤霉病抗病能力，其中在感病材料中更加明显；SA处理小麦叶片后，叶片的抗病能力提高，但是，MeJA处理反而降低了叶片对禾谷镰刀菌的抵抗能力。说明，SA可以提高小麦植株的整体赤霉病抗性，而JA在小麦穗部和叶片可能存在不同的调控机制。
　　3. NPR1转录调控因子在模式植物中已经验证为SA信号通路关键调控因子。为了明确SA和JA交叉反应及其在赤霉病抗性中的作用，本研究对小麦NPR1基因进行了表达分析。结果发现在小麦中TaNPR1可以受到禾谷镰刀菌的正向调控，与JA信号通路的趋势一致。而外源激素处理进一步证实其受JA调控，不受SA响应。另外，其同源基因TaNPR2和TaNPR3可以受SA和JA激素的双重调控。说明，NPR1在双子叶植物中参与了不同于单子叶植物的调控路径，而且，SA和JA信号传导路径在单子叶和双子叶植物中存在不同的调控机制。
　　4.为了进一步确认SA和JA的抗赤霉病功能，本研究利用BSMV-VIGS体系在小麦穗部对SA生物合成及信号传导关键基因TaNPR1、TaOPR3和TaICS1等进行沉默并进行抗病性鉴定，结果表明TaOPR3和TaICS1基因被沉默后小麦的赤霉病抗性与空载对照相比显著降低，发病小穗数明显增多；而沉默TaNPR1基因后小麦赤霉病抗性没有发生很大的变化，说明SA能够显著提高小麦赤霉病抗性，而TaNPR1基因可能不参与小麦的SA信号通路，而是通过其他信号路径发挥抗病作用。
　　5.为进一步深入研究SA的功能，本研究对禾谷镰刀菌侵染小麦过程进行了ROS染色，结果发现接菌处理可以诱导接菌小穗ROS的产生，造成接菌穗的HR反应，从而抑制病原菌的萌发和蔓延，提高小麦对赤霉病的抗延展能力。
　　6. DON是一种由赤霉菌产生的真菌毒素，它可以促进病原菌在植物体内的扩散。UGT家族成员能够将游离态的DON转变成低毒力的D3G，但是目前还很少在小麦抗赤霉病研究中见到此类报道。本研究中根据转录组数据发现病原菌侵染后期大量的UGT基因被诱导表达，根据转录组数据分析结果发现了一个在抗赤霉病小麦品种中特异表达，而且对DON和禾谷镰刀菌产生强烈响应的UGT家族成员TaUGT5。该基因拥有一个1431bp的ORF，可以编码476个氨基酸残基；利用中国春缺-四体材料将其定位于2B染色体；在中国春参考基因组A、B和D染色体组分别存在一个等位基因，但是只有2B染色体上的基因能够表达；过表达TaUGT5转基因拟南芥植株对DON毒素表现出较高的耐受性；在小麦中过表达TaUGT5，转基因植株的胚芽鞘抗赤霉病鉴定结果表明，转基因植株能够有效地抑制禾谷镰刀菌在胚芽鞘的蔓延速度；但是穗部和叶片的鉴定结果对赤霉病的抗性没有在胚芽鞘中表现的那么明显。亚细胞定位研究将TaUGT5编码蛋白定位于细胞膜上，这可能与TaUGT5的生物学功能有关，该基因的编码蛋白能够减少DON毒素对细胞膜的损害，保持细胞稳定性，从而降低赤霉菌在植物组织中的蔓延速度。

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中文摘要

英文摘要

1前 言

1.1小麦赤霉病概述

1.2小麦赤霉病的病害特征

1.3赤霉病菌的来源、发生和传播

1.4小麦赤霉病病原菌的侵染过程

1.5小麦赤霉病的有效治理

1.6 小麦赤霉菌毒素与致病性

1.7小麦赤霉病抗源研究进展

1.8小麦抗赤霉病机理研究现状

1.9小麦赤霉病抗病相关基因研究进展

1.10本研究的目的和意义

1.11本研究的主要研究内容

2材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

2.3技术路线

3结果与分析

3.1转录组数据分析

3.2小麦穗部接菌后新陈代谢过程

3.3 SA和JA通路关键基因的表达分析

3.4通路关键基因的BSMV-VIGS功能验证

3.5接菌小穗HR反应与SA信号途径的关系

3.6去毒化基因TaUGT5在小麦赤霉病中的功能研究

4讨论

4.1禾谷镰刀菌胁迫下小麦转录组数据分析

4. 2 SA 和JA 对小麦赤霉病抗性影响

4.3 活性氧迸发在小麦赤霉病抗性中的作用

4.4 TaUGT5是一个新的DON去毒化基因

4.5 TaUGT5存在等位点变异

4.6 TaUGT5过表达植物的赤霉病抗性

5结论

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表论文情况