元宝枫无性系DNA指纹图谱的构建

摘要

元宝枫（Acer truncatum Bunge）是槭树科槭树属原产中国的落叶乔木，属于重要的彩叶观叶树种，也是近些年来具有重要开发价值的经济树种，同时，随着元宝枫育种越来越受到重视，相关科研人员不断选育出更多的新无性系品种/品系，因此，研究元宝枫无性系品种/品系DNA指纹图谱的构建技术十分必要。本研究以课题组选育和收集的23个元宝枫无性系为研究对象，采集各无性系的叶片为试验材料，探究元宝枫叶片基因组DNA的最佳提取方法，建立了SRAP-PCR扩增的最佳反应体系，对其遗传多样性及亲缘关系进行了分析，构建了23个无性系优良品种的指纹图谱，为其以后的亲本选择，品种鉴定及新品种的保护及分类奠定了基础。主要研究结果如下：
　　1.确定了合适的DNA提取方法。通过采用传统的CTAB法、改良CTAB法与试剂盒法对元宝枫无性系叶片DNA进行提取，确定了适合元宝枫的叶片DNA提取的方法，即：改良CTAB法和试剂盒法。考虑到试验样品量不是很大，从节俭经费考虑最终确定采用改良CTAB进行本次试验。
　　2.建立了元宝枫SRAP-PCR的最佳反应体系。通过正交实验，得出了适合元宝枫无性系SRAP-PCR的最佳反应体系，即25μ L反应体系包括：10 X PCR buffer2.5μ L，TaqDNA聚合酶1.0U，随机引物浓度为引物0.3μ mol/L，MgCl2浓度为2.5mmol/L，dNTP2.0mmol/L，模板浓度为50ng。其中，各因素对PCR影响大小依次为：Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs、模板。SRAP一般PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1min，共5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
　　3.筛选出了合适的扩增引物。从90对引物中筛选出了能稳定扩增的16对引物，用于检测元宝枫无性系的遗传多样性及指纹图谱的构建，共获得谱带数为223条，其中197条为多态性位点，平均每对引物扩增谱带为13.9条，多态性位点为12.3条，多态性比率平均为88.34％；有效等位位点数在1.2653~1.5841之间，均值为1.4416;Nei's遗传多样性指数(H)在0.2024~0.3302之间，均值为0.2565；Shannon信息指数(I)0.3001~0.4897之间，均值为0.3937，表明参试元宝枫无性系间具有一定程度的遗传多样性。
　　4.建立的指纹图谱正确反映了无性系之间的亲缘关系。利用NTSYSpc2.10统计分析软件，采用遗传相似系数UPGMA法对23个元宝枫无性系进行聚类分析。结果表明：23个元宝枫无性系可以分为5大类，2014-N，1号单独化为两大类，第三类包括2013-4、5-2和5-3这三个无性系；第四类包括6-1、6-2、6-3、5-4四个无性系；第五类包括剩下的14个无性系。在0.77处（L3），14个无性系又可以划分为4亚类，第一亚类为2014-1；第二亚类2013-3；第三亚类由农1、1-1、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1X-3、1X-6，第四亚类为天3，京2和中2。可以将其分为5大类。与按照主要性状及亲缘关系等特征分类结果相符合，这说明SRAP分子标记对于元宝枫的研究是科学的，适用的。
　　5.指纹图谱的带型丰富且清晰可辨。利用6对核心引物对23个元宝枫无性系进行扩增，均获得了丰富且清晰可辨的谱带。扩增片段的大小主要集中在100-1500bp之间，其中引物ME1-EM4与ME2-EM1相互组合，可以完全区分23个无性系品种，置信概率达99.99％。

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1. 引言

1.1 元宝枫研究概况

1.2 分子标记技术的种类和方法

1.3 SRAP分子标记在园林植物中的运用

1.4 指纹图谱

1.5 本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2 试验方法

3结果与分析

3.1元宝枫无性系基因组DNA的提取

3.2元宝枫SRAP-PCR反应体系的优化及产物检测

3.3随机引物的筛选

3.4 23个元宝枫无性系的SRAP扩增结果及多态性分析

3.5元宝枫无性系的聚类与亲缘关系的分析

3.6 23个元宝枫无性系优良品种DNA指纹图谱的构建

4讨论

4.1基因组DNA的提取注意的问题

4.2 SRAP基本反应体系

4.3无性系材料之间亲缘关系分析

4.4无性系材料的选用

4.5 DNA指纹图谱的建立

5结论

5.1基因组DNA提取方法

5.2适用于元宝枫的SRAP反应体系的优化

5.3元宝枫SRAP遗传多样性的分析

5.4 23个元宝枫无性系之间的聚类结果及类型划分

5.5 元宝枫无性系品种指纹图谱的构建

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文