PRRSV GP5蛋白基因疫苗的构建及鉴定和三种分子佐剂的制备

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是能够引起妊娠母猪繁殖障碍和严重呼吸系统症状的一种传染性疾病，本病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），主要靶细胞是猪肺泡巨噬细胞。主要传播途径是空气传播、接触感染和精液传播，该病毒具有极强的传染性，常常给养猪业造成严重的经济损失。糖基化囊膜蛋白（GP5）含有2-4个糖基化位点，是病毒的主要保护性中和抗原，其诱导产生中和抗体，能够中和病毒，使病毒失去感染性，是新型基因疫苗设计的主要靶蛋白。
　　基因疫苗又称为DNA疫苗，即将外源性抗原基因连接到真核表达载体上，构建重组质粒，然后将质粒导入宿主体内，并在宿主细胞内表达抗原蛋白，刺激机体免疫系统，产生免疫应答反应。一定时限内，抗原基因在宿主细胞内持续表达，激活机体免疫应答，达到预防疾病的目的。与灭活疫苗、弱毒疫苗等相比基因疫苗具有生产成本低、便于储存和运输、持续性强、使用安全等优点，对于疾病作用显著，能够诱导产生更有效的免疫应答反应，但是核酸疫苗也有抗体产生慢、水平低等问题，配以有效佐剂是克服这些问题的有效途径之一。
　　第二信使c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP作为在细菌中发现的信号分子，在细菌的致病力、细胞壁的代谢平衡、细菌的生长以及生物膜形成等方面起到至关重要的作用，在真核生物体内，能够作为信号分子被宿主识别，激活先天免疫应答。第二信使作为一种免疫调节剂，能够很好的调节机体的免疫功能，因此，可成为具有潜力的免疫佐剂。
　　本实验构建了PRRSV GP5基因调控型真核表达质粒，并对其在真核细胞中的表达做了研究，摸索了c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制备及纯化方法，具体研究内容如下：
　　1. PRRSV GP5基因调控型真核表达质粒的构建及验证
　　提取实验室保存的猪繁殖与呼吸综合征病毒的总RNA，RT-PCR扩增的到GP5基因cDNA，克隆到基因调控型表达载体pXJ41上，转化大肠杆菌TransT1感受态，经过酶切鉴定后测序，没有碱基突变，得到pXJ41-GP5重组质粒，转染到Hela细胞当中，经间接免疫荧光和Western Blot实验证明，pXJ41-GP5重组质粒，能够在真核细胞内表达。
　　2. c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’ cGAMP的制备及检测方法
　　分别挑取含有霍乱弧菌VCA0956（合成c-di-GMP所必需的酶蛋白），VC0179（合成c-di-AMP所必需的酶蛋白）基因，以及含有mcGAS（合成2’-3’cGAMP所必需的酶蛋白）基因表达序列的大肠杆菌菌株，16℃低温诱导表达，利用Ni-NTA亲和层析制备VCA0956、VC0179、mcGAS三种酶蛋白，经过SDS-PAGE验证确定得到的蛋白即为目的蛋白，然后经分子筛层析纯化三种酶蛋白。在酶和底物存在的情况下，根据c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP的反应式，建立酶促反应体系，制备三种分子佐剂，经过摸索反相高效液相色谱条件，确定出峰时间以及纯度，纯化所需小分子。
　　该研究为c-di-GMP、c-di-AMP、2’-3’cGAMP与pXJ41-GP5联合免疫增强PRRSV GP5基因疫苗免疫效果方面的研究奠定了基础。