一氧化氮对肥城桃果实线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶的调控机理

摘要

腺嘌呤核苷酸转位酶（adenine nucleotide translocator，ANT）是线粒体通透性转换孔道(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的重要组成部分，参与调控MPTP的生理功能，可以诱导细胞凋亡，但其在植物体中发挥的作用机理并不明确。一氧化氮（nitric oxide，NO）作为气体分子，以其脂溶性的特点是三大生命信息传递信使中第一信使的一员，在植物体中介导多种生理功能，参与调控线粒体的生理功能，参与植物幼苗的生长、果实的成熟等过程；而适当浓度的外源 NO能延长果实的储存时间。所以，探明NO对ANT蛋白的作用及其调控机理有助于明确ANT蛋白对肥城桃桃果实采后保鲜的影响，对优化延长桃果实储存时间的方法有重要意义。
　　本论文中的实验均以肥城桃桃果实为实验材料。从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）获取已知的玉米、水稻等ANT基因的mRNA序列，通过比对得到ANT的保守区序列，以该保守区序列设计兼并引物，从肥城桃桃果实提取出总 RNA并克隆获得 cDNA。使用RACE技术，以克隆获得的cDNA为模板，得到ANT基因的cDNA序列全长1432 bp，编码区1155 bp，共编码384个氨基酸。经模拟分析，ANT发生谷胱甘肽化反应比发生亚硝基化反应更容易进行，NO与ANT蛋白有且仅有一种可能发生相互作用。构建ANT-pET30a重组载体，导入大肠杆菌Transetta(DE3)进行蛋白表达，使用镍柱纯化目的蛋白，再经过透析复性，超滤管过滤浓缩，得到纯化复性后的ANT蛋白。
　　利用酵母双杂交技术检验ANT蛋白和PiC蛋白之间是否能相互作用，结果显示菌株能够正常生长并且显现蓝色，表明两者可以相互作用。从 NO与纯化复性后的ANT蛋白作用的荧光光谱中发现，NO可以使ANT蛋白发生荧光猝灭的现象，且属于静态猝灭。通过Scatchard模型分析得到，NO与ANT以2:1的结合形式相互作用形成复合物。从ANT实时荧光定量PCR研究中发现，15μmol L-1 NO处理降低了ANT的表达量。外源NO对肥城桃桃果实线粒体的生理生化指标的研究结果表明：经15μmol L-1 NO处理的桃果实线粒体中ROS含量明显的下降，同时增强了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，降低了线粒体中MDA的含量，减少了线粒体呼吸的耗氧量，进而降低细胞的呼吸作用。而经c-PTIO处理的得桃果实线粒体中ROS含量显著提高，同时也减弱了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，MDA的含量也明显升高，增加了线粒体的耗氧量。随桃果实储存时间的延长，线粒体膜电势整体呈下降的趋势，而15μmol L-1 NO处理有效的减缓了线粒体膜电势的降低速率。80 mmol L-1 NAC-15μmol L-1 NO协同处理可以使线粒体中ROS、MDA含量显著降低，提高 SOD的活性，减缓线粒体膜电势的降低，降低线粒体的耗氧量。结果表明外源NO通过调控线粒体的各项生理功能，达到延缓肥城桃桃果实的细胞凋亡，延长肥城桃桃果实采后的储藏时间的作用。

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1 引言

1.1 腺嘌呤核苷酸转位酶

1.2 一氧化氮与植物线粒体的生理代谢

1.3 研究内容及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 线粒体腺嘌呤转位酶（ANT）全长cDNA的克隆

3.2 ANT全序列分析

3.3 ANT蛋白体外表达、纯化与复性

3.4 ANT与PiC蛋白质的相互作用

3.5 NO与ANT的相互作用

3.6 NO对ANT基因表达量的影响

3.7 NO处理对桃果实线粒体功能的影响

4 讨论

4.1 ANT基因序列的克隆与蛋白序列的分析

4.2 ANT蛋白的表达、纯化与复性

4.3 NO与ANT蛋白的相互作用

4.4 NO对ANT表达量的影响

4.5 ANT蛋白与PiC蛋白的相互作用

4.6 NO对桃果实线粒体功能的影响

5 结论

创新之处

参考文献

致谢

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