sipW基因突变对解淀粉芽孢杆菌PEBA20生物膜形成及抑菌活性的影响

摘要

sipW基因是芽孢杆菌属细菌的重要调控基因，表现出多种功能。本研究以植物内生生防细菌解淀粉芽孢杆菌PEBA20为材料，利用同源重组法构建了sipW基因缺失突变株，进而测定了该基因对PEBA20生物膜形成、抑菌活性和芽孢形成的影响。
　　本文主要研究结果如下：
　　1、将sipW同源前臂和同源后臂的连接产物sipWF-sipWB与自杀质粒PMUTin4经双酶切、T4连接酶连接得到重组自杀质粒sipWF-sipWB-PMUTin4。将重组质粒经电转化方法转化入B.amyloliquefaciens PEBA20感受态细胞中，采用红霉素筛选法筛选获得sipW基因缺失的PEBA20突变株；以缺失株DNA为模板进行PCR筛选阳性克隆，并通过测序确定获得sipW基因缺失突变株。
　　2、观察了B.amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株的液气界面和固气界面生物膜形成过程，发现sipW基因缺失突变株固气界面生物膜结构复杂程度略显简单，液气界面生物膜也较野生株为简单，表明sipW基因调控了解淀粉芽孢杆菌生物膜形成过程。
　　3、检测B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和sipW突变株对三种植物病原真菌和三种植物病原细菌的抑菌活性。结果显示，与野生株相比，sipW基因缺失突变株对三种指示真菌和三种指示细菌抑菌效果均下降，并且对其中某些真菌和细菌的抑菌作用差异显著水平较为显著。表明sipW基因的缺失突变影响了解淀粉芽孢杆菌对真菌和细菌的抑菌作用。
　　4、对B.amyloliquefaciens PEBA20野生株和sipW突变株的菌体芽孢形态检测结果显示，sipW基因缺失突变株能产生芽孢，且突变株的菌体与野生株相比差异不显著。表明sipW基因缺失突变株可能不影响芽孢的形成。

目录

声明

英文缩略词及中文对照表

1 引言

1.1 生防细菌中芽孢杆菌的研究现状

1.2 生物膜

1.2.1 细菌生物膜的概念

1.2.2 细菌生物膜形成动态发展过程

1.2.3 细菌生物膜形成的调控基因

1.2.4 细菌生物膜研究现状

1.3 抗菌活性

1.3.1 抗菌活性物质简介

1.3.2芽孢杆菌生物膜形成与芽孢形成的关系

1.3.3 芽孢杆菌生物膜形成与抗菌活性的关系

1.4 sipW研究进展

1.5 基因打靶技术

1.5.1 同源重组技术

1.5.2 结合反向筛选标记的两步单交换同源重组

1.6本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 溶液与培养基配制

2.1.3 仪器与试剂

2.2 方法

2.2.1 sipW基因缺失突变株的初步构建

2.2.2 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株生物膜表型测定

2.2.3 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株抑菌活性的测定

2.2.4 sipW基因缺失突变株芽孢及菌体形态特征测定

3 结果与分析

3.1 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株的构建

3.1.1同源前臂sipWF与同源后臂sipWB的PCR扩增

3.1.2 同源前臂sipWF与同源后臂sipWB的单酶切及连接

3.1.3sipWF-sipWB连接产物的克隆

3.1.4 sipWF-sipWB与PMUTin4酶切产物的连接及重组质粒的克隆

3.1.5 sipWF-sipWB-PMUTin4重组质粒电转化至解淀粉芽孢杆菌PEBA20

3.1.6 sipW基因序列分析

3.2 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株的生物膜形态测定

3.2.1气液界面生物膜形态

3.2.2 固气界面生物膜形态测定

3.3 抑菌活性的测定

3.3.1 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株发酵液抑菌活性的测定

3.3.2 B. amyloliquefaciens PEBA20野生型菌株和sipW基因缺失突变株菌活体对真菌性病害抑菌活性的测定

3.4 sipW基因缺失突变株芽孢及菌体形态测定

4 讨论

4.1 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株的构建

4.1.1 sipW基因的确定

4.1.2 PMUTin4自杀质粒的选择

4.1.3 外源DNA导入宿主细胞

4.1.4 转化子筛选和鉴定

4.2 B. amyloliquefaciens PEBA20 sipW基因缺失突变株的形态生理学测定

4.2.1 sipW基因缺失突变株生物膜检测

4.2.2 sipW基因缺失突变株抑菌活性检测

4.2.3 sipW基因缺失突变株芽孢菌体检测

5 结论

参考文献

致谢