对人工饲料不同摄食性家蚕品种（品系）SSR标记分析及pkg1基因的表达研究

摘要

家蚕作为重要的经济昆虫，在人类生产生活及文化历史上均有非常重要的地位。而家蚕是寡食性昆虫，桑叶是其天然饲料，栽桑才能养蚕，这制约了蚕桑业的发展。用人工饲料养蚕是蚕业史上的一项重要的技术革新，是今后我国养蚕业发展的方向。但目前我国人工饲料养蚕技术尚未达到实用化的要求，现行蚕品种对人工饲料的摄食性较差是制约该技术发展的主要障碍，提高家蚕对人工饲料的摄食性和适应性成为研究的重点。前人已从生理学和遗传学等方面对家蚕食性做了大量的研究，并取得了丰硕的成果，但家蚕食性相关的分子机理尚未完全明确，与家蚕摄食性相关的“食性基因”尚未获得。
　　本研究以对人工饲料摄食性差异明显的家蚕品种（品系）为材料，利用微卫星标记（Simple Sequence Repeats，SSR）技术对家蚕食性相关的分子标记进行分析。并采用实时荧光定量PCR方法测定了环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶基因1（cGMP dependent protein kinase gene1，pkg1）在人工饲料摄食性不同的家蚕品种（品系）中的表达特征，采用药物激活PKG的方法对pkg1基因进行功能验证，以期探明PKG与家蚕食性的关系。主要获得如下结果：
　　1.以广食性家蚕品种中广04和低食性家蚕品种鲁七、菁松A高食性品系和低食性品系、菁松B高食性品系和低食性品系3对对人工饲料摄食性存在很大差异的家蚕品种（品系）为材料，利用152对SSR分子标记引物对供试家蚕品种（品系）进行SSR-PCR扩增，共筛选出18个多态性SSR特异标记，主要位于第3、7、9、10、12、13、14、16、17、19、20和21号染色体上。20号染色体上的SSR标记最多，为3条，且多由高食性家蚕品种（品系）扩增出来，说明促进家蚕摄食人工饲料的基因可能位于20号染色体上，并且S2009为高食性家蚕品种（品系）的特异性引物，这进一步说明促进家蚕摄食的基因很可能位于20号染色体的S2009标记附近。S1902也多为高食性家蚕品种（品系）的特异引物，说明在19号染色体的S1902位点附近也有可能存在与食性相关的基因。S0911和S1603多为低食性家蚕品种（品系）的特异引物，说明抑制家蚕摄食的基因有可能位于9号染色体的S0911和16号染色体的S1603位点附近。由此推测，家蚕食性相关性状可能受多基因控制，属于数量性状。并且不同家蚕品种（品系）的摄食性基因可能存在一定差别，食性的遗传模式也将不同。
　　2.以广食性家蚕品种中广04、菁松A和菁松B高食性家蚕品系及菁松A和菁松B低食性家蚕品系的3龄起蚕头部为材料，检测摄食性不同的家蚕品种（品系）中 pkg1基因的表达特征。pkg1在高食性家蚕品种（品系）中的表达量均显著高于低食性品种（品系）。pkg1基因在5龄96 h家蚕的组织表达特异性测定表明，该基因在家蚕头部、中肠、脂肪体、马氏管及丝腺中均有表达，其中在脂肪体中的表达量最高，马氏管次之，在头部和中肠中的表达量最低。
　　3.对广食性家蚕品种中广04、低食性家蚕品种鲁七、菁松A高食性和低食性家蚕品系4龄起蚕进行饥饿处理，均会导致pkg1基因的表达量显著升高。分别用桑叶、不含桑叶粉的人工饲料和忌避剂（樟脑）对这4种家蚕品种（品系）进行气味刺激，然后检测家蚕头部 pkg1基因的表达变化。结果表明，桑叶、不含桑叶粉的人工饲料和忌避剂的气味刺激对 pkg1基因在不同品种（品系）中的表达影响不同，桑叶气味刺激能使高食性和低食性家蚕品种（品系）之间的pkg1表达差异减小；不含桑叶粉的人工饲料刺激引起低食性品种（品系）pkg1的表达量显著下调，使高、低食性家蚕之间的pkg1表达差异增大；樟脑对不同品种（品系）pkg1基因的表达影响较小。本试验结果说明，pkg1可能与家蚕的食性有密切关系，可能具有促进家蚕摄食人工饲料的功能，其具体机理有待于进一步研究。
　　4.给4龄起蚕44 h的菁松B高食性家蚕幼虫添食不同浓度的8-Br-cGMP，结果显示，随着8-Br-cGMP浓度的增加，家蚕对人工饲料的摄食性显著降低。给5龄起蚕24 h的优食一号家蚕幼虫注射不同浓度的8-Br-cGMP溶液，结果表明，当注射浓度为500μM、1000μM和5000μM时，家蚕对人工饲料的摄食性随着注射浓度的增加而显著变差，并且当注射浓度为5000μM时，家蚕出现中毒现象，在注射48 h后恢复正常。给5龄起蚕24 h的优食一号家蚕幼虫注射不同浓度的cGMP溶液，家蚕对人工饲料的摄食性并无显著变化。因此，pkg1基因与家蚕食性相关的功能需要采用其他方法进一步验证。

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1 前言

1.1 家蚕的食性

1.2 分子标记极其在家蚕研究中的应用进展

1.3 昆虫PKG基因与食性的关系研究进展

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 家蚕不同品种（品系）对人工饲料的摄食性鉴定

3.2 家蚕不同食性品种（品系）SSR分子标记分析

3.3 对人工饲料不同摄食性家蚕品种pkg1基因的表达特征

4 讨论

4.1 家蚕食性相关的SSR分子标记

4.2 pkg1基因的选择及实验材料的选择

4.3 pkg1基因与食性的关系

4.4 今后有待进一步研究的课题

5 结论

参考文献

致谢

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