家蚕不同发育阶段抗坏血酸含量变化及其合成关键酶同源基因的研究

摘要

抗坏血酸又称为维生素C（VC），在生物体内具有重要的生理功能。从低等的单细胞生物到高等的动植物，很多生物均能从头合成还原型抗坏血酸（AsA）。但目前对于昆虫自身能否合成AsA尚不明确。虽然AsA对于家蚕幼虫是必需的营养物质，但在卵期和蛹期等不取食阶段，体内 AsA的含量在特定发育时期都保持相对稳定。目前还没有研究确定家蚕体内的AsA仅来源于食物而自身不能合成。为此，本文测定了家蚕在不同发育阶段体内抗坏血酸含量的变化，探讨了 AsA合成代谢关键酶的同源基因及其表达变化。
　　首先，本试验用分光光度法测定了家蚕在不同发育时期以及不同条件下总抗坏血酸（TAA）和AsA含量的变化。结果表明，对于取食阶段的家蚕幼虫采用缺乏VC的人工饲料饲养，虽然与正常饲料饲养的家蚕相比生长发育相对缓慢，但仍能发育到4龄。滞育卵中TAA含量在产卵72 h内、AsA含量在产卵24 h内均有所增加，此后二者的含量有不同程度降低，并一直保持相对稳定。正常胚胎发育的蚕卵，产卵24 h内AsA含量显著增加，产卵48 h~144 h，AsA含量一直保持较高水平，直到胚胎发育后期才明显下降，而且非滞育卵的AsA含量一直高于滞育卵。幼虫期取食桑叶或添加VC的人工饲料之后，TAA含量和AsA的含量增加，眠中、取食缺乏VC的人工饲料及饥饿一定时间后，蚕体中的TAA和AsA的含量均明显降低，尤其是饥饿幼虫的AsA含量下降到很低的水平。蛹期TAA含量无显著变化，但雌蛹体内AsA含量在化蛹0~24 h显著升高，雄蛹体内AsA含量总体上在0~144 h变化不显著，一直保持较高的含量，直到蛹的后期AsA含量才有较为明显的下降。
　　其次，利用已知生物的AsA合成酶基因的氨基酸序列在家蚕数据库中比对检索AsA合成酶的同源基因、利用MEGA等生物信息学软件对基因的氨基酸序列进行比对和分析，获得AsA合成代谢最后一步的关键酶古洛糖酸内脂氧化酶（GULO）及倒数第二步的关键酶醛糖内脂酶（ALase）的同源基因分别为：BmGULO_like1、BmGULO_like2和BmALase_like1、BmALase_like2。由于从低等单细胞生物到高等的灵长类，几乎均含有完整或部分AsA合成酶基因，并且AsA具有的广泛的生理功能，推测家蚕中应该也存在此基因。
　　最后，利用Primer软件设计家蚕的4个AsA合成酶同源基因的引物，采用荧光定量PCR检测了AsA合成相关酶同源基因在家蚕不同发育阶段的表达变化。结果表明，BmGULO_like1、BmGULO_like2、BmALase_like1和BmALase_like2等4个基因在卵期及蛹期的中肠和脂肪体中的表达量总体上都显著高于幼虫期的中肠和脂肪体，并且这4个基因的表达量在卵期和蛹期都随着发育进展呈上升趋势。
　　本试验结果提示，在胚胎发育过程中及蛹期存在 AsA的来源途径，可能包括AsA自身合成途径及由氧化型抗坏血酸（DHA）还原为 AsA途径，而在幼虫期主要从食物中吸收VC，缺乏其他来源。根据研究结果推测，虽然家蚕中GULO的同源基因与其他已知生物的相似度较低，但家蚕仍有可能具有合成AsA的能力；具有多重功能的ALase其结构相对保守且分布物种极其广泛，并且在家蚕中的同源基因也具有高度保守性。

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1 前言

1.1 维生素C在生物体内的生理功能

1.2 抗坏血酸的生物合成途径

1.3 抗坏血酸合成代谢相关酶基因的研究概况

1.4 生物维持体内抗坏血酸含量的其他代谢酶

1.5 家蚕抗坏血酸合成关键酶的同源基因研究概况

1.6 无脊椎动物和家蚕对维生素C的营养需求及本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验数据统计分析

3 结果与分析

3.1 人工饲料育条件下VC的家蚕生长发育的影响

3.2 家蚕不同发育阶段及不同处理体内的AsA和TAA含量的变化

3.3 抗坏血酸合成关键酶基因的进化分析

3.4 家蚕不同发育阶段AsA合成代谢关键酶同源基因的表达变化

4 讨论

4.1 关于家蚕不同发育阶段体内抗坏血酸的含量变化及其来源

4.2 关于家蚕基因组中AsA合成关键酶的同源基因

4.3 家蚕AsA合成关键酶同源基因的表达特征

5 结论

参考文献

致谢

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