产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立及初步应用

摘要

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens）可产生多种致死性的外毒素，容易引发畜禽的各种产气荚膜梭菌病，以及人们的食物中毒、创伤性气性坏疽，严重影响人们身体健康，给各国的养殖业和公共卫生造成了一定的损失，因此临床上产气荚膜梭菌病的诊断非常重要。目前诊断该病的主要方法为病原菌的分离鉴定、肠内容物的毒素检测，产气荚膜梭菌病主要是由肠源性感染引起，常形成肠源性毒血症，并不一定形成菌血症及败血症，因此从内脏实质器官不一定能分离到细菌，若只从肠道分离到产气荚膜梭菌没有诊断价值；小鼠中和试验检测发病动物肠内容物中的产气荚膜梭菌毒素，已逐渐被更加敏感的ELISA方法所代替，但其作为疾病确诊的依据也受到质疑；特别是 A型产气荚膜梭菌引起的疾病，肠道内α毒素的检测及分离到大量产气荚膜梭菌都不能成为确诊的依据，因此迫切需要一种方法能检测产气荚膜梭菌的致病作用以明确诊断。
　　本研究以A型产气荚膜梭菌（NCTC528）为主要的产毒菌株，进行α毒素的高效厌氧产毒，通过 Enterotoxaemia ELISA kit、小鼠半数致死量（LD50）和SDS-PAGE方法测定所产培养物上清中的α毒素；应用所产毒素对试验家兔进行人工腹腔注射、肌肉注射α毒素，及时采集72h内死亡家兔的器官组织：心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠、大脑、小脑和延脑，制备组织切片，用于后续病理组织学检查和免疫组化方法的优化建立。结果显示：所制备的同批次α毒素对小鼠的LD50为2-4.25/mL，对家兔的最小致死量（MLD）为2 mL，即38倍小鼠 LD50；人工注射的α毒素通过血液循环致使胃绒毛上皮细胞空泡变性、坏死，小肠、盲肠的肠上皮细胞坏死、脱落，粘膜下层充血，还致使相关重要的实质器官组织出现了充血、出血、红细胞溶血及主质细胞变性、坏死的急性损伤。以抗重组α毒素杂交瘤细胞制备的单克隆抗体（2A11）为基础（抗体效价达1:102400），通过对免疫组化程序中的组织固定、抗原修复、封闭条件、单抗2A11稀释度、酶标二抗和DAB显色等多个试验条件进行摸索和优化，优化建立了单抗介导免疫组化检测方法。该方法可特异性的检测到人工感染兔心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠和延脑中的α毒素分布，其中胃、小肠、肾脏组织中的α毒素信号强度较强，主要分布于主质细胞的细胞质中，这为今后探讨产气荚膜梭菌α毒素的致病机理提供了手段和参考。应用建立的免疫组化法，结合病原分离培养、Multiplex PCR方法，对2013年10月~2015年9月期间采集的山东省5个规模化兔场疑似梭菌性肠炎病例进行诊断，结果显示：本研究共分离到32株产气荚膜梭菌，毒素型均为A型，分离率为64％(32/50)。免疫组化检测显示：在50只疑似感染兔的器官组织中，有47只兔可检测到α毒素，其阳性检测率为94%，在采集的病兔肾脏、肝脏、胃和小肠组织中可检测到α毒素阳性信号。本研究结果表明：山东省部分地区规模化兔场中发生的5起兔腹泻疫情与产气荚膜梭菌的感染高度相关，94%发病兔感染了兔梭菌性肠炎，78.7%的发病兔出现了产气荚膜梭菌肠毒血症，流行的产气荚膜梭菌的毒素型为A型；免疫组化法检测疑似梭菌性肠炎病兔组织中α毒素的阳性率显著高于病原菌的分离率，因此所建的免疫组化法可以弥补常规病原菌分离鉴定的不足，为本病的诊断提供更加可靠的依据。

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1 前言

1.1 产气荚膜梭菌的研究概述

1.2 产气荚膜梭菌α毒素提取与检测方法的研究概述

1.3 免疫组织化学检测方法的研究进展

1.4 研究目的及意义

2材料和方法

2.1 材料

2.2 A型产气荚膜梭菌α毒素的制备

2.3 A型产气荚膜梭菌α毒素的检测

2.4 人工感染家兔产气荚膜梭菌α毒素

2.5 组织切片的制备及病理组织学检查

2.6 小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备

2.7 单抗2A11介导免疫酶组化染色方法的优化建立

2.8 特异性实验

2.9 产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的初步应用

3 结果与分析

3.1 A型产气荚膜梭菌产毒效果的检测结果

3.2 人工感染产气荚膜梭菌α毒素的家兔临床剖检变化

3.3 人工感染产气荚膜梭菌α毒素的家兔组织病理学检查结果

3.4小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备

3.5 免疫组化方法的优化结果

3.6 特异性检测结果

3.7 免疫组化法对人工感染家兔各组织器官中α毒素的检测结果

3.8 对临床家兔疑似产气荚膜梭菌病例的检测结果

4 讨论

4.1 免疫组化方法的优化及其建立

4.2 产气荚膜梭菌α毒素在人工感染家兔组织中的分布特点

4.3 临床疑似兔梭菌性肠炎的诊断

4.4 检测产气荚膜梭菌α毒素与兔自然感染梭菌性肠炎的关系

5 结论

参考文献

附录

致谢

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