巴贝斯虫中两种硫氧还蛋白(TrX)的克隆和功能鉴定

摘要

田鼠巴贝斯虫属于顶复门原虫，是一种胞内寄生虫，其缺乏过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，主要通过硫氧还蛋白系统来抵抗宿主免疫细胞产生的活性氧族分子（reactive oxygen species，ROS）和活性氮族分子（reactive nitrogen species，RNS。目前巴贝斯虫的Trx的功能尚不清楚，本研究从巴贝斯虫转录组中筛选出两种硫氧还蛋白分子，Trx5和Trx6，克隆得到其全长基因。本实验通过快速扩增方法分别得到基因Trx5和Trx6的全长序列。Trx5全长770bp，含有一个编码201个aa的开放阅读框，蛋白大小约23KD，无信号肽，具有一个典型的Trx结构域。Trx6全长660bp，含有一个编码142aa的开放阅读框，蛋白大小约17KD，没有信号肽，具有一个硫氧还蛋白样结构域和一个有丝分裂DIM1结构域。Western Blotting和IFAT研究表明，BmTrx5和BmTrx天然蛋白均存在于虫体中。通过胰岛素还原法检测Trx5和Trx6的活性，其原理为：Trx在TrxR、NADPH的作用下可以从氧化型转变为还原型,还原型Trx（Trx-(SH)2）含有巯基，作用胰岛素，自身又变为氧化型，氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫键，在TrxR、NADPH的作用下变成还原型，这个过程需要消耗NADPH，使NADPH转变成NADP+，还原型Trx继续与胰岛素作用，重复此过程。随着NADPH的消耗，反应体系在340nm处的吸光值（OD值）会降低，两个分子的His重组蛋白均表现出氧化还原活性。此研究为抗巴贝斯虫药物和疫苗的开发提供了信息和理论基础。