泰山松花粉多糖对重组PRRSV GP5蛋白免疫增强作用的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度接触性的病毒性疾病，发病率高，死亡率也高，最易感动物是妊娠母猪和1月龄内的仔猪，主要引起猪的呼吸困难和繁殖障碍性疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。现阶段使用的PRRSV商品化疫苗主要是减毒活疫苗和灭活苗。常用的PRRSV减毒活疫苗存在加速PRRSV毒株变异的风险，而灭活疫苗仅能诱导极其有限的保护性免疫反应。PRRSV亚单位疫苗是PRRS免疫预防的一个重要研发方向，但是亚单位疫苗通常免疫原性较低，因此，筛选针对PRRSV亚单位疫苗的高效免疫佐剂是提高现有亚单位疫苗免疫效力的重要途径。本研究以原核表达的高致病性PRRSV囊膜糖蛋白5（GP5）为免疫原，不同剂量的泰山松花粉多糖（Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharides，TPPPS）作为免疫佐剂，以评定TPPPS对GP5蛋白诱导免疫应答的免疫增强作用。
　　本研究主要包含以下两个部分：
　　1、PRRSV GP5重组质粒鉴定与蛋白表达：将重组质粒pET-32a-GP5用PCR、双酶切进行鉴定并测序，验证正确的重组质粒pET-32a-GP5转化至BL21(DE3) pLysS感受态细胞中，进行原核蛋白的表达。将表达的蛋白SDS-PAGE分析得到大小约为32 KD的目的条带。同时，Western-Blot鉴定，结果可清晰看见约32 KD大小的特异性印迹，与SDS-PAGE分析的结果相一致。然后，将获得的蛋白通过His标签镍层析柱进行纯化。
　　2、泰山松花粉多糖对重组PRRSV GP5蛋白的免疫增强作用：本研究选取72只SPF昆明小鼠，随机分为6组（Ⅰ-Ⅵ）。Ⅰ组注射纯化的GP5蛋白，Ⅱ-Ⅳ组分别注射不同浓度的TPPPS（20、40、60 mg/mL）佐剂+GP5蛋白，Ⅴ组注射弗氏佐剂+GP5蛋白，Ⅵ组注射PBS；1周后加强免疫1次。每周随机挑选3只小鼠采其外周血，用ELISA检测其抗GP5抗体效价，流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的比例，用MTT比色法检测T淋巴细胞转化率，以ELISA试剂盒分别检测IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子浓度。结果表明，所有疫苗免疫组小鼠的以上免疫指标均有显著提高，而添加TPPPS和弗氏佐组的各项指标均显著高于单独GP5蛋白接种组。3个浓度的TPPPS佐剂中，60 mg/mL TPPPS的免疫增强效果最好。本研究表明，PRRSV GP5蛋白诱导了特异性免疫应答反应，TPPPS佐剂对GP5蛋白具有理想的免疫增强作用。这为PRRSV GP5蛋白亚单位疫苗的研制提供了理论依据和技术依托。

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1.前言

1.1猪繁殖与呼吸综合征

1.1.1 PRRSV生物学特性

1.1.2 PRRSV分子生物学研究

1.1.3 PRRS流行现状

1.1.4 PRRS致病机理

1.1.5临床症状及病理变化

1.1.6诊断和防制

1.2疫苗的发展现状

1.2.1传统疫苗

1.3疫苗佐剂的研究现状

1.3.1不溶性铝盐类佐剂

1.3.2油乳佐剂

1.3.3表面活性剂类佐剂

1.3.4细菌微生物类佐剂

1.3.5中药类佐剂

1.3.6多糖佐剂

1.4松花粉多糖的研究进展

1.5本研究的目的与意义

2.材料与方法

2.1重组质粒pET-32a-GP5的鉴定与蛋白的表达

2.1.1试剂与仪器

2.1.2试剂和培养基的配制

2.1.3重组质粒pET-32a-GP5的鉴定

2.1.4重组PRRSV GP5蛋白的表达与纯化

2.2泰山松花粉多糖对PRRSV GP5蛋白的免疫增强作用

2.2.1主要试剂与仪器

2.2.2主要试剂的配制

2.2.3亚单位疫苗及免疫佐剂制备

2.2.4动物试验及免疫程序

2.2.5松花粉多糖对小鼠体液免疫测定

2.2.6松花粉多糖对小鼠细胞免疫的影响

2.2.7数据分析

3.结果

3.1重组质粒pET-32a-GP5的鉴定与蛋白表达

3.1.1重组质粒pET-32a-GP5的鉴定

3.1.2重组PRRSV GP5蛋白的表达

3.1.3重组PRRSV GP5蛋白的纯化

3.2松花粉多糖对小鼠体液免疫的影响

3.2.1血清抗体效价

3.2.2免疫血清对PRRSV的中和作用

3.2.3血清中IL-4含量的变化

3.3松花粉多糖对小鼠细胞免疫的影响

3.3.1血清中IFN-γ含量的变化

3.3.2血清中IL-2含量的变化

3.3.3外周血CD4+T淋巴细胞百分含量

3.3.4外周血CD8+T淋巴细胞百分含量

3.3.5外周T淋巴细胞转化率

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

个人简介

攻读硕士学位期间发表论文情况