槲皮素和球孢白僵菌对小菜蛾酚氧化酶基因翻译表达的影响

摘要

酚氧化酶（phenoloxidase，简称PO，EC.1.14.18.1）在昆虫的生长发育和内源性免疫过程中具有重要功能，如具有黑化或包被入侵的病原物、昆虫伤口的愈合等功能。酚氧化酶及其抑制剂一直是国内外科学家研究的热点。
　　本论文以小菜蛾为研究对象，在制备获得小菜蛾PxPPO1和PxPPO2基因抗体的基础之上，利用蛋白质印迹技术（Western Blot）研究了槲皮素和球孢白僵菌（Beauveria bassiana）处理小菜蛾后，小菜蛾酚氧化酶蛋白翻译表达水平的相对变化，从而来探讨外来效应物对酚氧化酶基因在翻译水平上的影响。主要结果如下：
　　1.成功制备获得小菜蛾PxPPO1和PxPPO2基因的多克隆抗体。
　　2.分别对内参基因β-actin以及目的基因PxPPO1和PxPPO2进行了Western Blot曝光饱和分析，根据上样量与信号饱和点出现的时间，确定Western Blot试验中上样量为10μg。
　　3.采用微量点滴法，用不同浓度槲皮素处理小菜蛾3龄幼虫，处理不同时间后，PxPPO1和PxPPO2基因翻译相对表达量随槲皮素浓度升高而明显减少。
　　4.采用浸渍法，用球孢白僵菌侵染小菜蛾3龄幼虫，成功侵染不同时间后，PxPPO1和PxPPO2基因翻译相对表达量在处理2h时比对照处理提高，在6h、12h、24h和48h时蛋白表达量均比对照处理减少。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1酚氧化酶研究进展

1.2球孢白僵菌研究进展

1.3槲皮素研究进展

1.4 Western blot简介

1.5选题目的和意义

1.6本研究的技术路线

2材料与方法

2.1试剂仪器及设备

2.2序列分析及基因合成

2.3 PxPPO1原核表达载体的构建

2.4 PxPPO2原核表达载体的构建

2.5蛋白表达和纯化

2.6免疫以及血清制备

2.7抗原亲和纯化以及抗体鉴定

2.8试虫的饲养及处理

2.9试虫总蛋白的提取及浓度标定

2.10 SDS-PAGE电泳

2.11 蛋白质印迹Western Blot

2.12 Western Blot曝光饱和分析

2.13槲皮素处理

2.14球孢白僵菌处理

3结果与分析

3.1序列分析

3.2 基因合成

3.3 重组载体构建及测序分析

3.4 蛋白表达和纯化

3.5抗体鉴定结果

3.8曝光饱和分析

3.9槲皮素处理后PO蛋白相对表达量

3.10球孢白僵菌侵染后PO蛋白相对表达量

4讨论

4.1序列分析

4.2槲皮素处理小菜蛾3龄幼虫PxPPO1、PxPPO2翻译表达量

4.3球孢白僵菌侵染小菜蛾3龄幼虫PxPPO1、PxPPO2翻译表达量

5结论

6附图

6.1 PxPPO1基因序列分析

6.2 PxPPO2基因序列分析

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况