转罗布麻DEAD-box解旋酶基因(AvDH1)棉花的耐盐性鉴定

摘要

棉花的耐盐性较强，是开发盐碱地的先锋作物，但是棉花品种间的耐盐性差异很大，高盐胁迫严重影响棉花的产量和品质，因此，利用基因工程提高棉花的耐盐性具有重要的意义。解旋酶是一类普遍存在于微生物、动物和植物中的动力蛋白分子。DNA解旋酶能够打开双链DNA并参与DNA的复制、修复、重组和转录，RNA解旋酶能够催化RNA二级结构的解旋并参与转录、核糖体的合成和翻译起始等过程。近年来研究发现，解旋酶不仅调控植物生长发育，而且在植物应答非生物胁迫过程中起重要作用。
　　实验室之前从盐生植物罗布麻中克隆了一个盐诱导表达的DEAD-box解旋酶基因AvDH1（登录号：EU145588），构建pBI121表达载体，利用农杆菌介导法将其导入陆地棉常规栽培种鲁613中，初步鉴定了一些转基因棉花植株。本研究通过分子、生理生化和盐碱地种植等试验，对转AvDH1基因耐盐棉花进行了系统鉴定筛选，获得了耐盐性稳定的转基因株系，同时对罗布麻DEAD-box解旋酶AvDH1在棉花中的同源基因进行分析，利用转录组测序，分析盐胁迫条件下转基因株系和受体的基因差异表达，揭示DEAD-box解旋酶提高棉花耐盐性的分子机制，获得的主要结果如下：
　　1.利用PCR、Southern和Northern分析，从分子水平上确定罗布麻DEAD-box解旋酶AvDH1已经整合入受体棉花基因组并且稳定遗传，选取三个纯合转AvDH1基因株系08-66、08-87、08-26进一步分析它们室内和田间鉴定的耐盐性。
　　2.室内耐盐性鉴定表明：正常条件下转AvDH1基因棉花和对照棉花的生长状况和耐盐相关的生理指标差异不显著，盐胁迫处理条件下，转基因棉花种子的发芽率和植株的株高均显著高于对照，其叶片离子渗透和MDA含量均显著低于对照，转基因株系叶片SOD酶活性、脯氨酸含量和K+/Na+离子比均显著高于对照，而三个转基因株系之间的差异不显著。
　　3.2013年和2014年在东营盐生植物园进行盐碱地实验，在中盐地块（ECe9.8 ds m-1）和高盐地块（ECe15.6dsm-1）对转AvDH1基因棉花的农艺性状进行鉴定。两年的盐碱地鉴定结果表明：在中盐地块上转基因株系08-66、08-87和08-26比对照棉花的籽棉产量分别高15.4％、17.9%和15.9%，而在高盐地块上分别高23.9%、26.4%和23.1%，转基因棉花产量的增加受益于铃数和铃重的增加。
　　4.为了进一步研究转罗布麻DEAD-box解旋酶基因（AvDH1）提高棉花的耐盐性机制，利用RNA测序技术，对转基因耐盐棉花和受体鲁613棉花进行盐胁迫差异表达基因分析，结果表明：盐胁迫处理后，非转基因株系中共有1359个基因表达发生差异表达，转基因植株中共有1150个基因表达发生差异表达，其中751个基因上调表达，399个基因下调表达。选取部分差异表达显著的基因进行qRT-PCR验证，结果显示与RNA测序差异表达基因趋势基本一致。在差异表达基因中，有35个基因是耐盐相关的转录因子。对差异表达基因参与的主要代谢途径进行分析，鉴定了差异表达基因参与耐盐的主要代谢途径为：磷脂酰肌醇信号途径、过氧化物酶体途径、核糖体合成途径以及RNA降解途径等。
　　5.利用生物信息学的方法，从雷蒙德氏棉花中鉴定了161个RNA解旋酶基因，并将它们分为DEAD-box、DEAH-box、和DExD/H-box三个亚家族，其中，AvDH1和DExD/H-box亚家族中GrDExD/H4和GrDExD/H30同源（蛋白水平同源性7
　　4%）。共线性分析表明GrDExD/H4和GrDExD/H30存在共线性关系，表达聚类分析表明，GrDExD/H4和GrDExD/H30在棉花不同组织和不同发育阶段高表达，表明Gr DExD/H4和GrDExD/H30可能具有重要的作用。

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1引言

1.1盐胁迫对植物的影响

1.2植物耐盐机制研究进展

1.3解旋酶研究进展

1.4本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3结果和分析

3.1转AvDH1基因棉花的耐盐性鉴定

3.2盐诱导转AvDH1基因棉花的表达谱分析

3.3雷蒙德氏棉基因组范围内的RNA解旋酶基因家族分析

4讨论

4.1棉花过量表达AvDH1提高棉花的耐盐性

4.2过量表达AvDH1基因提高棉花耐盐的生理基础

4.3转AvDH1基因棉花和受体棉花的差异表达基因

4.4雷蒙德氏棉花基因组范围内的RNA解旋酶基因家族分析

4.5进一步的研究设想

5结论

参考文献

致谢

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