CRH和皮质酮影响小鼠着床前胚胎发育的机制：体外模型研究

摘要

心理应激时机体激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，从不同水平对雌性生殖系统产生多层次的抑制作用。HPA轴的主要中枢调节因子是CRH和精氨酸加压素（AVP），两者协同作用于垂体前叶促进ACTH和其他阿黑皮素原（POMC）衍生肽（如β-内啡肽）分泌，随后ACTH作用于肾上腺皮质促进肾上腺合成并释放糖皮质激素（GCs）。CRH和其诱导产生的β-内啡肽抑制促性腺激素释放激素（GnRH）分泌，肾上腺皮质分泌的GCs则抑制促黄体激素（LH）和卵巢中雌二醇、孕酮的产生，使靶组织或器官对雌二醇产生抗性。因此，应激过程中产生的CRH和GCs对雌性生殖系统的不利影响是非常明显的。本实验室前期研究认为，小鼠合子形成初期束缚应激48 h，可使胚胎发育能力明显降低，进而导致妊娠率降低，然而有关其作用机理并不清楚。因此，本实验选取CRH和GCs，通过体外直接添加或与小鼠输卵管上皮细胞（OECs）共培养或制取条件化培养液（CM）培养小鼠原核胚，探索CRH和GCs对着床前胚胎发育的影响，并对其作用机制进行深入研究。
　　结果表明：
　　（1）培养液中直接添加CRH不会损伤着床前胚胎发育（P＞0.05），但与OECs共培养时添加CRH能明显降低原核胚发育至囊胚的比例（P＜0.05）。利用WB检测发现小鼠OECs表达CRHR蛋白，且CRH促进其表达（P＜0.05）；利用激光共聚焦显微镜观察发现早期胚胎（囊胚阶段除外）都不表达CRHR蛋白，这说明CRH通过与OECs中CRHR结合，对小鼠早期胚胎体外发育产生不利作用。对OECs氧化应激指标检测发现，CRH造成细胞内GSH还原能力下降（P＜0.05），过氧化物TOS水平以及OSI值升高（P＜0.05），清除过氧化物的还原酶如SOD酶水平降低（P＜0.05）、但过氧化氢酶水平升高（P＜0.05），分泌的促胚胎发育生长因子水平降低（P＜0.05），说明CRH诱导OECs发生氧化应激。进一步检测发现，OECs表达Fas水平升高（P＜0.05），培养液中FasL水平升高（P＜0.05），说明OECs启动死亡受体途径，进而检测到细胞表达Caspase-3水平升高（P＜0.05），细胞发生晚期凋亡的比例明显升高（P＜0.05）。
　　（2）培养液中直接添加GCs不会损伤着床前胚胎发育（P＞0.05），但与OECs共培养时添加GCs能显著降低原核胚发育至囊胚的比例（P＜0.05）。利用WB检测发现小鼠OECs表达GR蛋白，且GCs下调其表达（P＜0.05）；利用激光共聚焦显微镜观察发现不同发育阶段早期胚胎都表达GR蛋白。接着我们利用荧光定量RT-PCR检测早期胚胎，没检测到11-HSD1 mRNA表达，但GCs上调11-HSD2 mRNA表达水平（P＜0.05）。因此，GCs可能通过11-HSD2解除对早期胚胎发育的直接阻碍作用，但可能通过与OECs中GR结合对胚胎发育产生不利作用。对OECs氧化应激指标检测发现，GCs造成细胞内GSH还原能力下降（P＜0.05），过氧化物TOS水平以及OSI值升高（P＜0.05），清除过氧化物的还原酶如SOD酶水平降低（P＜0.05）、过氧化氢酶等水平升高（P＜0.05），分泌的促胚胎发育生长因子水平降低（P＜0.05），说明GCs诱导OECs发生氧化应激。进一步检测发现，OECs表达Fas水平升高（P＜0.05），培养液中FasL水平升高（P＜0.05），说明OECs启动死亡受体途径，进而检测到细胞表达Caspase-3水平升高（P＜0.05），细胞发生晚期凋亡的比例明显升高（P＜0.05）。
　　总之，CRH或GCs通过与OECs中各自的受体结合，导致OECs发生氧化应激，并诱导OECs的凋亡。OECs凋亡进而引起囊胚的GSH还原能力下降（P＜0.05），Fas和Caspase-3水平升高（P＜0.05），说明对着床前胚胎也造成了氧化应激并发生凋亡，导致原核胚发育至4-细胞和囊胚的比例明显下降以及囊胚细胞数降低。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1应激

1.2氧化应激与雌性生殖

1.3细胞凋亡与信号通路

1.4本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3数据统计

3结果

3.1小鼠OECs体外培养体系建立

3.2 CRH对小鼠着床前胚胎体外发育的影响

3.3 GCs对小鼠原核胚体外发育的影响

3.4 gld小鼠验证

4讨论

4.1小鼠OECs培养体系建立

4.2 CRH对早期胚胎发育的影响

4.3 GCs对早期胚胎发育的影响

4.4氧化应激降低胚胎发育水平

4.5细胞凋亡降低胚胎发育水平

结论

参考文献

致谢

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