拟南芥EXO70B家族蛋白调控生长素极性运输的初步研究

摘要

植物激素生长素几乎调控着植物生长和发育的所有方面。极性生长素的运输是通过生长素外运载体PIN介导的，PIN蛋白在质膜上极性定位。在整个发育过程中生长素能够快速的调控基因转录，主要是通过快速调控Aux/IAA蛋白的水平。 胞吐是植物中一个非常重要的过程，胞吐被胞吐复合体所介导，胞吐复合体由8个亚基组成，其中包括EXO70。在拟南芥中EXO70包含有23个成员。我们获得了一个T-DNA插入的功能缺失型突变体exo70B1-3。通过对突变体的转录水平的检测，突变体中的转录水平明显降低。 exo70B1-3突变体在拟南芥植株中有着明显的表型，与野生型相比，在幼苗期侧根数目较多。在侧器官中表达，响应生长素的基因LOB在突变体根中的转录水平明显升高。突变体的莲座叶较小且发黄，向地性加快。在不同浓度的NAA处理实验中，突变体表现出主根抑制率较大，LOB的转录水平发生紊乱。突变体根中的DR5::GFP明显增强，这暗示着突变体内生长素水平发生紊乱。PIN2是生长素极性外运蛋白，极性定位在质膜的顶端，突变体内的PIN2循环迟移。可能是突变体exo70B1-3可以影响PIN蛋白的极性定位，从而进一步影响生长素的转录调控，影响植物的生长发育。 通过酵母双杂实验发现EXO70B1，EXO70B2与Aux/IAA互作，其中包括IAA2， IAA5，IAA17，IAA18等Aux/IAA蛋白。通过蛋白截短进一步发现EXO70B1，EXO70B2可与Aux/IAA的功能域IV相互作用，且Aux/IAA是与EXO70B1的N端相互作用的。通过GUS染色发现EXO70B1，EXO70B2和IAA5组织特异性相似，进一步增强它们之间互作的可能性。通过LUC荧光进一步验证蛋白之间的互作关系。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1 植物激素生长素

1.1.1 生长素分布模型

1.1.2 生长素的极性运输

1.1.3 生长素信号途径

1.2胞吐

1.2.1胞吐拴系过程

1.2.2胞吐复合体

1.2.3植物胞吐复合体

2 材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 拟南芥材料及生长条件

2.1.2 烟草材料及生长条件

2.1.3 菌株与质粒

2.1.4 各种酶及生化试剂

2.1.5 各种缓冲液及培养基配方

2.1.6 引物设计

2.2 实验方法

2.2.1 植物总DNA的提取

2.2.2 植物总RNA的提取、反转录及定量分析

2.2.3 构建植物转基因表达载体的步骤

2.2.4 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的转化

2.2.5 Y2H酵母双杂交

2.2.6 拟南芥的栽培与转化

2.2.7 转基因拟南芥阳性植株的筛选

2.2.8 烟草的瞬时侵染

2.2.9 拟南芥BFA处理和洗脱实验

2.2.10 GUS染色

2.2.11 植物细胞壁PI染色

2.2.12 共聚焦显微镜观察和图像处理

3 结果与分析

3.1 EXO70B1功能缺失突变体的获得及鉴定

3.2 exo70B1-3突变体的表型分析

3.2.1 突变体的根形态发生异常

3.2.2 突变体的根的向地性发生变化

3.2.3 突变体对外源生长素NAA的响应

3.2.4 突变体根部生长素水平发生异常

3.2.5 突变体影响生长素外运蛋白PIN2的循环

3.3 EXO70家族蛋白与Aux/IAA家族的互作探究

3.3.1 EXO70B1，EXO70B2可与Aux/IAA家族成员互作

3.3.2 EXO70B1，EXO70B2可与Aux/IAA家族成员的功能域IV互作

3.3.3 EXO70B1的N端与Aux/IAA家族成员互作

3.3.4 EXO70B1，EXO70B2与IAA5在幼苗中共定位

3.3.5 LUC荧光检测EXO70B1，EXO70B2与IAA18的互作关系

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢