拟南芥光信号蛋白FHY3/FAR1调控淀粉合成及能量饥饿响应功能分析

摘要

太阳光提供了地球上一切生命体的能量来源，对植物正常生长发育至关重要。生物体在长期的进化过程中形成了非常保守的能量储存和代谢的精细调控机制，从而保证生物体更好的适应昼夜变化的外界环境。在植物叶片中，在白天时，光合作用产生的糖分除直接提供各种生命活动所需能量外，剩余糖分以淀粉形式进行能量的暂时储存；在夜间时，植物叶片细胞内储存的淀粉降解产生糖，从而满足植物生长和代谢所需能量。当植物储存的能量不足或消耗过度进入能量匮乏状态时，会诱导一系列碳饥饿相关基因表达，改变机体物质代谢和能量代谢过程，严重时引发自噬过程从而抑制植物正常生长发育进程。已有研究表明植物体内的淀粉合成和降解过程受到昼夜变化的光信号、内源糖信号以及生物节律的共同调控，但是其分子调节机制并不清晰。 光不仅为植物光合作用提供能量来源，同时也作为重要的环境信号直接调控植物生长发育过程。为了解析光信号蛋白对植物淀粉代谢和能量代谢的分子调控机制，本研究针对模式植物拟南芥中不同光信号蛋白相关突变体的淀粉积累和延长黑暗的适应性进行分析，发现光信号蛋白FHY3（Far-red ElongatedHypocotyl3）及其同源蛋白FAR1 （Far-red Impaired Response 1）在植物淀粉合成代谢和碳饥饿引发的能量匮乏过程中具有重要调控作用。光信号蛋白 FHY3和FAR1 是远红光信号转导途径中一类从古老的Mutator 类转座酶衍变而来的新型转录因子，主要以同源或异源二聚体的形式特异结合在下游靶基因的FBS顺式调控元件上并调控其基因表达（Wangand Deng, 2002; Linet al., 2007）。本研究以FHY3及FAR1功能缺失突变体中光下淀粉合成减少以及黑暗转光下时植株异常死亡的表型为出发点，从分子生物学以及反向遗传学的方法解析了光信号蛋白FHY3介导植物体内淀粉合成代谢和能量代谢精细调控的分子机制。 主要研究结果如下所示： （1）在光照结束时，FHY3及FAR1功能缺失突变体（fhy3，fhy3 far1）中淀粉碘染色较野生型植株浅，推测FHY3和FAR1是植物体内淀粉合成过程的正向调控子。进一步，通过淀粉和可溶性多糖WSP定量测定以及透射电镜淀粉粒形态观察，发现fhy3以及fhy3 far1突变体中淀粉含量显著减少，WSP含量显著升高，且淀粉粒结构异常，表明FHY3和FAR1正向调控植物体内淀粉合成过程。 （2）通过检测fhy3以及fhy3 far1突变体中淀粉代谢相关基因的转录水平变化，并结合FHY3蛋白的ChIP-Seq结果分析，发现淀粉去分支酶ISA2是光信号蛋白FHY3的候选下游靶基因。进一步，通过酵母单杂交、ChIP技术以及RT-qPCR证实FHY3直接结合ISA2基因的启动子区域并正向调控其基因表达。另外，通过在fhy3 far1双突变体中组成型过量表达ISA2，发现ISA2-OX/fhy3 far1转基因株系中淀粉及WSP含量得到完全恢复，且其淀粉粒形态恢复正常，表明光信号蛋白FHY3通过直接激活ISA2的基因表达促进植物体内淀粉合成。 （3）外源施加糖显著诱导ISA2的基因表达，而在葡萄糖感受蛋白HXK1突变体gin2以及fhy3 far1双突变体中外源施加糖诱导ISA2的表达量降低，表明光信号蛋白FHY3同时介导光信号和糖信号诱导的ISA2的基因表达和淀粉合成。 （4）通过对成苗期野生型No-0，fhy3以及fhy3 far1突变体进行延长黑暗转光下处理，发现野生型植株能够正常生长，而突变体植株具有不同程度的异常死亡现象，揭示了光信号蛋白FHY3在暗光转变过程中具有重要调控作用。进一步研究发现，在光下， fhy3 far1突变体内单线态氧大量积累和光合作用蛋白修复异常是暗光转变过程中导致植株死亡的直接原因。 （5）通过透射电镜观测发现，黑暗条件下，fhy3以及fhy3 far1突变体内叶绿体膜及内囊体超微结构异常，可能是导致植株暗光转变过程中光氧化损伤的内在原因。同时， fhy3以及fhy3 far1突变体中自吞噬相关基因表达量显著升高，且自噬关键因子ATG5与FHY3的双突变体atg5 fhy3具有显著提前衰老表型，表明光信号蛋白FHY3是黑暗下细胞自吞噬过程的关键负向调控因子。 （6）黑暗条件下，fhy3 far1突变体内能量匮乏相关基因DIN1及DIN6表达显著升高。进一步通过外源施加糖处理显著缓解fhy3 far1突变体细胞死亡以及光氧化损伤表型，证明碳饥饿引发的能量匮乏是导致fhy3 far1暗光转变过程中细胞死亡的重要原因，而FHY3能够提高植物对饥饿胁迫的抗逆性。 （7）通过探究FHY3与能量匮乏响应过程中重要激酶SnRK1的?亚基AKIN10之间的关系，发现 FHY3 与 AKIN10 的生理功能互相拮抗，且能够直接蛋白相互作用。RT-PCR检测发现AKIN10诱导的多个下游基因在fhy3突变体中表达量升高，而FHY3直接激活下游靶基因CCA1以及ELF4在akin10突变体中表达量降低。对FHY3蛋白序列分析发现，FHY3蛋白存在预测的AKIN10磷酸化位点，推测AKIN10通过与 FHY3直接相互作用，协同调控植物对能量匮乏的响应过程。 本研究发现，在光照条件下，光信号蛋白FHY3和FAR1通过直接结合淀粉去分支酶ISA2基因的启动子区域并正向调控其基因表达，从而参与光信号和糖信号介导的淀粉合成过程。同时，在黑暗条件下，FHY3作为碳饥饿引发能量匮乏的关键负向调控因子。FHY3通过与能量代谢关键调控因子AKIN10的直接相互作用，协同调控植物对能量匮乏的响应过程，从而促使植物更好的昼夜变化的外部环境。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1光信号转导

1.2光信号转导蛋白FHY3和FAR1

1.3淀粉

1.4 植物能量代谢

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 光信号蛋白FHY3调控淀粉代谢的分子机理研究

3.2 光信号蛋白FHY3响应能量饥饿的表型及机理探究

4 讨论

4.1 转录因子FHY3对植物体内淀粉合成代谢的影响

4.2 转录因子FHY3调控植物体内淀粉合成代谢的机理研究

4.3 光信号和糖信号对ISA2转录水平调控及淀粉合成的影响

4.4 转录因子FHY3在植物能量饥饿响应过程中的作用

4.5 昼夜交替转变对植物生长发育的影响

5 结论

参考文献

致谢

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