不同葡萄糖代谢途径在小鼠卵母细胞成熟中的作用：用siRNA基因沉默技术的研究

摘要

卵母细胞的成熟包括核成熟和胞质成熟。核成熟是指第一次减数分裂的恢复，并最终排出第一极体；胞质成熟是指着床前胚胎发育能力获得的过程。卵母细胞发育能力是反映胞质成熟的最直接指标。尽管关于糖代谢对小鼠卵母细胞核成熟的作用研究很多，但究竟是哪条糖代谢通路支持卵核成熟还不完全明确，而且没有人利用 siRNA来研究不同葡萄糖代谢途径对小鼠卵母细胞核成熟和胞质成熟的作用。本研究将首先建立一个在不含葡萄糖情况下能维持小鼠卵母细胞较高核成熟和较差胞质成熟的培养体系。然后，用此体系在添加葡萄糖的情况下培养小鼠卵母细胞，并通过抑制剂和siRNA 下调糖代谢不同途径相关酶的活性/表达，观察卵母细胞核成熟和胞质成熟指标，最终确定不同糖代谢途径对小鼠卵母细胞成熟的作用。实验结果表明： 1、葡萄糖不能支持DOs完成核成熟，乳酸钠促进约20% 的DOs完成核成熟，而丙酮酸钠可以支持几乎所有DOs完成核成熟； 2、DHEA或碘醋酸钠抑制G6PD或GAPDH活性后，共培养DOs的成熟率显著降低，并且DHEA组比碘醋酸钠组降低地更明显； 3、转染 siRNA下调卵丘细胞中 G6PD或 GAPDH蛋白表达后，共培养 DOs的成熟率、卵母细胞孤雌激活后的囊胚率、DOs中谷胱甘肽总量（GSX）和 ATP水平均显著降低； 4、转染siRNA下调卵丘细胞中G6PD蛋白表达后，共培养DOs中 GSH/GSSG和NADPH含量显著降低，而 ROS水平显著升高。转染 siRNA下调卵丘细胞中 GAPDH表达后，共培养DOs中GSH/GSSG、NADPH和ROS水平均没有显著变化； 5、4-CIN 或鱼藤酮抑制卵母细胞中 MPC 或线粒体呼吸链的活性后，DOs 的成熟率显著降低； 6、显微注射 siRNA下调卵母细胞中 MPC1或 NDUFV1蛋白表达后，DOs的成熟率均显著降低； 7、草氨酸钠抑制卵母细胞中LDH活性后，DOs的成熟率显著降低。 总之，本研究的主要结论为：1）DOs 利用葡萄糖和乳酸钠的能力有限，但却较容易地利用丙酮酸钠来支持成熟；2）卵丘细胞中 PPP和糖酵解途径对共培养 DOs 核成熟起重要作用，但 PPP 起的作用更关键；3）卵丘细胞中糖酵解途径通过提供 ATP 来 支持DOs胞质成熟，PPP通过提供ATP和减少氧化应激从而更大程度地支持DOs胞质成熟；4）丙酮酸钠通过线粒体丙酮酸载体转运并经线粒体电子传递来支持卵母细胞核成熟；5）乳酸经乳酸脱氢酶催化成丙酮酸钠和NADH来支持卵母细胞核成熟。 本研究对于了解卵母细胞成熟机理、改进成熟培养系统和提高卵子质量具有重要意义。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1卵母细胞成熟

1.2卵丘细胞和卵母细胞的葡萄糖代谢

1.3线粒体丙酮酸载体和线粒体呼吸链及其对卵母细胞的作用

1.4 siRNA

1.5本文的主要研究内容

2材料与方法

2.1主要试剂及配制

2.2实验动物

2.3小鼠COCs的收集和DOs制备

2.4 DOs单独培养

2.5 siRNA显微注射及注射后DOs的抑制和成熟培养

2.6卵丘细胞单层的制备和siRNA转染

2.7 DOs与卵丘细胞单层共培养

2.8卵母细胞孤雌激活

2.9胚胎培养

2.10蛋白质电泳

2.11卵母细胞内GSH、ROS、ATP和NADPH的检测

2.12数据分析

3结果

3.1 CCM通过代谢葡萄糖促进小鼠卵母细胞核成熟

3.2抑制剂作用CCM中G6PD或GAPDH对共培养小鼠DOs核成熟的影响

3.3 siRNA下调卵丘细胞中G6PD或GAPDH的表达对共培养DOs成熟的影响

3.4抑制剂作用MPC或线粒体呼吸链对小鼠卵母细胞核成熟的影响

3.5 siRNA下调DOs中MPC1或NDUFV1的表达对核成熟的影响

3.6抑制剂作用LDH对小鼠卵母细胞核成熟的影响

4讨论

4.1小鼠卵母细胞成熟培养系统的建立

4.2糖代谢途径与卵母细胞核成熟

4.3卵丘细胞中PPP和糖酵解途径与卵母细胞胞质成熟

4.4 DOs成熟过程中利用葡萄糖、乳酸及丙酮酸的能力

5 结论

参考文献

致谢

攻读期间论文发表情况