水貂肠炎细小病毒分离株的分子生物学特性及其致病性研究

摘要

在2015-2016年间，我们在中国的主要水貂养殖区内收集了176份水貂肠炎病料，并成功分离出了8株细小病毒，分别命名为：MEV-SD1、MEV-SD2、MEV-SD3、MEV-SD4、MEV-SD5、MEV-SD6、MEV-SD7和 MEV-SD8。采用DNAStar软件将8株新分离细小病毒的VP2基因序列进行比对，发现它们之间的核苷酸同源性达到99.4％-100%，与参考毒株的同源性为97.9%-100%。MEV-SD3与MEV-SD5的同源性为100%，且与日本FPV-V211毒株的同源性最高，达到了99.9%。8株 MEV VP2之间的氨基酸同源性为99.0%-99.8%，与参考株之间的同源性为97.9%-99.7%，VP2氨基酸的突变主要发生在10个位点中。8株MEV NS1核苷酸之间的同源性为99.8%-100%，与参考毒株间的同源性为98.7%-100%。同时，8株MEV NS1氨基酸之间的同源性为99.3%-99.9%，与参考毒株间的同源性为98.1%-99.9%，NS1蛋白基因并无特征性的氨基酸突变。
　　食肉动物身上分离的细小病毒VP2的300位氨基酸，对决定它们的抗原性以及宿主选择性都起着至关重要的作用。多数MEV的VP2300位的氨基酸为Val，但我们分离的6株细小病毒MEV-SD1至MEV-SD6中300位氨基酸突变成了Ala，与FPV在300位氨基酸一致。另外两株水貂肠炎细小病毒MEV-SD7和MEV-SD8的300位则还为原来的Val，通过分析MEV与FPV VP2的蛋白质，发现300位氨基酸是区别两株病毒的关键氨基酸。基于VP2核苷酸的系统发育分析表明，8株新分离的MEV形成了两个分支，MEV-SD1至MEV-SD6与所有的FPV参考毒株位于同一个独特的分支上，因此通过以上分析表明这6株新分离的细小病毒是FPV。
　　针对NS1蛋白基因我们也进行了分析，结果只有极个别的氨基酸发生了替换，并没有形成实质性的突变。细小病毒编码的NS1蛋白基因在遗传进化方面相对保守，它的主要功能是在病毒转录和复制过程中起着重要作用，但却不能够对细小病毒宿主选择性起到实质性的影响。基于NS1基因的系统发育分析表明MEV与FPV位于一个大的分支上，并且8株新分离的MEV位于一个更小的进化分支上，同时还包含着3株FPV，显示了与FPV更亲近的同源性，这进一步证实了MEV-SD至MEV-SD6是FPV。
　　在动物致病性试验中发现感染MEV-SD1的水貂在接种后的24小时后就开始发病，发病后的水貂精神沉郁，食欲下降或废绝，渴欲增加，体温升高。肠胃症状明显，有呕吐的迹象，严重腹泻，排出稀软到水状样或脓状样粪便。4天后水貂的发病率为100%，死亡率为38.9%，动物半数致死量为104.75 TCID50。剖解死亡水貂能发现胃肠道表现明显，小肠粘膜呈坏死性、出血性、纤维蛋白性炎症。组织病理学观察发现肠黏膜上皮细胞肿胀，肠绒毛上皮细胞凝固性坏死、脱落，固有层内单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞浸润。致病性实验说明了新分离的貂源 FPV对水貂的致病性很强，能够引起水貂很高的发病率和致死率。
　　同时，血清学调查发现，采集的84份健康水貂血清，其中抗MEV中和抗体效价大于10的只有10份水貂血清，仅占11.9%，其余的74份水貂血清中抗MEV中和抗体效价均小于10，高达88.1%。这表明了中国的水貂养殖产业还没有形成足够的规模化，家庭式的饲养模式占据了大多数，这也导致了水貂饲养环境的脏、乱、差，管理方式的粗放性，饲养物种的多样性，疫苗免疫程序的不合理性等，都直接造成了MEV的不断突变以及与其它细小病毒的重组。
　　综上研究证明，我们分离的6株新型细小病毒毒株MEV-SD1至MEV-SD6为FPV，也证实了 FPV是导致我省水貂病毒性肠炎的主要病因。因此，我们以后需要加强对水貂肠炎细小病毒的监控，以防止出现新的大流行毒株，并且制定出一个更合理有效的疫苗免疫程序。