一氧化氮对桃果实脂氧合酶的调控作用

摘要

香气赋予果实特征的风味感官，构成每种果实特有的“香气特征谱”或“香气指纹”，在果实风味构成中具有决定性作用。桃果实果实中的香气物质非常复杂，其中含有大量的挥发性的物质，主要有醛类、醇类、酯类、内酯类、萜类和酮类等。脂肪酸是形成一些果实香气成分主要的前体物。脂肪酸途径是大多数植物香气物质形成的主要来源，也是桃果实特征香气物质合成的主要途径，通过该途径可形成醇、醛、酯和内酯。脂肪酸的合成途径主要是脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径。LOX途径是将亚油酸、亚麻酸反应生成氢过氧化物，然后和氢过氧化物裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）反应生成己醛或者己烯醛，醛类与醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）反应生成相应的醇类，醇类与醇酰基转移酶（alcohol acyltransferases，AAT）反应生成相应的酯类。
　　为了考察一氧化氮（nitric oxide, NO）对贮藏过程中肥城桃果实香气物质合成的影响，本文研究了NO对LOX途径中的重要酶——LOX的调控作用。以采后肥城桃为材料，用不同浓度NO溶液处理生理成熟期的桃果实，考察了常温和冷藏过程中不同处理的桃果实中LOX活性的变化。结果发现，桃果实LOX活性在常温和冷藏过程中整体均呈上升趋势。与对照相比，15μmol L-1 NO处理比5μmol L-1 NO和30μmol L-1 NO处理的活性更低，NO处理抑制了LOX活性。
　　从美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）获取LOX家族基因的4个mRNA序列。通过该保守区序列设计出qPCR的兼并引物，从肥城桃的桃果实中提取出总RNA，并克隆获得cDNA。以TUB为内参，计算LOX-1、LOX-2、LOX-3和LOX-4拷贝数与TUB拷贝数之比。分析了LOX基因表达水平，常温和冷藏过程中桃果内 LOX家族基因的表达量均呈下降趋势。NO对 LOX-1、LOX-2、LOX-3基因表达先促进后抑制，NO对LOX-4基因表达则是先抑制后促进，15μmol L-1 NO处理比5μmol L-1 NO和30μmol L-1 NO处理的效果更明显。
　　构建了LOX-2-pET-30a、LOX-3-pET-30a重组载体，导入大肠杆菌Transetta(DE3)进行蛋白表达。经蛋白模拟分析，LOX的四种蛋白发生谷胱甘肽化反应比发生亚硝基化反应更容易进行，NO与LOX-1、LOX-2、LOX-3、LOX-4蛋白的活性中心可以通过氢键发生反应。NO通过调控桃果实中LOX基因的表达来控制脂氧合酶的活性，进而影响桃果实芳香性物质的合成。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1 果实风味

1.2 桃果实中芳香物质的成分

1.3 桃果实中香气成分的生物合成途径

1.4 影响桃果实香气品质的因素

1.5 酯类合成关键酶LOX

1.6 iTRAQ技术

1.7 研究内容及意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 NO处理对桃果实脂氧合酶的影响

3.2 iTRAQ测定NO处理后桃果实LOX蛋白的含量分析

3.3 LOX蛋白体外表达

3.4 桃果实LOX蛋白模拟分析

4 讨论

4.1 NO与酯类合成关键酶的作用

4.2 iTRAQ测定NO处理后桃果实LOX蛋白的含量分析

4.3 LOX重组蛋白的表达

4.4 LOX蛋白序列的分析

5 结论

创新之处

参考文献

致谢

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