三株马立克氏病病毒野毒株的分离鉴定及其致病性分析

摘要

禽马立克氏病（Marek，s disease，MD）是由鸡马立克氏病病毒引起的（Marek，s disease virus，MDV）一种高度接触性传染病，可引起禽的恶性淋巴肿瘤性疾病。近年来，在一些即使已经免疫了CVI988/Rispens等商品疫苗的鸡群，仍然会发生MDV的感染并引起肿瘤的发生，给当前家禽产业造成了严重的经济损失。我们有兴趣知道这类发生免疫失败的鸡群中鸡马立克氏病病毒是否发生了致病性和主要致病基因的变化，为此，本研究对从不同CVI988/Rispens商品疫苗的鸡群中分离鉴定了三株MDV野毒株，并对其主要致病基因进行了克隆测序和序列分析，并对纯化后的毒株开展了致病性实验。
　　1.不同鸡群中MDV野毒株的分离鉴定和主要致病基因序列分析
　　为了研究近年来我国MDV的流行和分布情况、毒力变化及其分子衍化的规律，本研究通过临床剖检，病毒分离， IFA检测和致病基因的扩增从曾免疫过商品化疫苗CVI988/Rispens的3个白羽肉种鸡场发病鸡的淋巴细胞中分离到三株适应鸡胚成纤维细胞的MDV野毒株（分别命名为SDAU1501、SDAU1502、SDAU1503）。对3株MDV的主要致病基因vIL8、pp38、meq基因进行了PCR扩增并与标准参考毒株进行氨基酸序列比较分析发现: SDAU1503株与CVI988和814株亲缘关系较近，而SDAU1501和SDAU1502株与中国早期分离的GX0101亲缘关系较近。同源性分析发现SDAU1503株的meq基因与CVI988/Rispens同源性最高为99.1％，而SDAU1502与SDAU1501同源性100%，且与GX0101相同；pp38基因相对保守，SDAU1503和SDAU1502与GX0101序列完全一致，而SDAU1501与GX0101的同源性为99.7%，与其他国外参考毒株的同源性也高达99.3%；vIL8基因SDAU1503与4个国外标准毒株同源性最高为99.3%，而SDAU1501和SDAU1502与GX0101同源性最高，分别为98.5和99.3%，与国外参考毒株的同源性为97%。根据对MDV三个致病基因的序列比较发现，SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株氨基酸同源性很高，而SDAU1503的致病基因与弱毒疫苗株氨基酸同源性很高，但对于其各自的致病性还需要进一步的致病性试验研究。
　　2.近期分离MDV野毒株的致病性分析
　　为了进一步观察对分离到的3株MDV野毒株的致病性，将3株MDV野毒人工感染1日龄海蓝褐蛋鸡进行了致病性试验研究。结果显示，SDAU1501和SDAU1502毒株毒力较强，感染SDAU1501和SDAU1502的鸡出现临床症状最早被发现于攻毒后21天，鸡只死亡最早出现于攻毒后的25天，发病鸡羽毛松乱，临床症状主要集中于7-10周，感染SDAU1501毒株的海蓝褐鸡群可以达到100%和90%的发病率和死亡率，以及54%的肿瘤发生率，感染SDAU1502毒株的海蓝褐鸡群可以达到100%和77%的发病率和死亡率，以及44%的肿瘤发生率；SDAU1503毒株毒力较弱，感染SDAU1503病毒的鸡出现临床症状主要集中于10-12周，临床症状最早出现于攻毒后47天，死亡时间最早出现于攻毒后52天，发病率可达到70%，但死亡率和肿瘤发生率却只有34%和14%左右。对感染了3株病毒的自然死亡鸡只和攻毒16周后剖杀的鸡只逐只进行剖检发现，3株MDV病毒均能引起不同程度的心脏、肝脏和肾脏肿瘤，并且个别鸡只出现了皮肤、腺胃和卵巢的肿瘤。感染了SDAU1501和SDAU1502的鸡群，在感染病毒后第6-8周的死亡鸡剖检主要可见到豆粒大小的心脏肿瘤；肝脏、脾脏肿大，零星出现肿瘤，感染后10-12周的死亡鸡只开始出现弥散性的肝脏肿瘤，感染病毒后的14-16周，部分的发病的死亡鸡只剖检可以看见腺胃肿瘤性病变。但感染SDAU1503的鸡只，肿瘤发生的时间稍有延迟，但出现肝脏病变的时间要早于心脏的病变，攻毒后的第8周的死亡鸡只剖检可见肾脏和肝脏的肿瘤，在14-16周零星可见心脏肿瘤。
　　本研究结果表明，近年来MDV新的变异不断发生，且毒力逐步变强，对MD的监测应当继续下去，同时，在现有MDV疫苗对野毒株的保护效力方面进行全面系统评估。

目录

声明

符号说明

前言

1.1马立克氏病（MD）的研究进展

1.1.1病原学

1.1.2流行病学

1.1.3发病机理和病理变化

1.1.4临床症状及发病机理

1.1.5诊断技术

1.2 MDV的分子生物学研究进展

1.2.1 MDV的基因组结构

1.2.2 MDV的结构蛋白及相关基因

1.3 DNA片段克隆的载体系统

1.3.1 质粒

1.3.3 细菌人工染色体载体系统（BAC）

1.3.4 利用BAC构建MDV感染性克隆

1.3.5 基于MDV细菌人工染色体载体系统的同源重组技术

1.4 MD的防制

1.4.2 目前MDV疫苗的种类

1.5 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2.1 主要实验器材和仪器

2.1.1分子克隆相关试剂

2.1.2常规细胞培养相关试剂

2.1.3其他主要试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5相关菌种、病毒株及载体

2.2 三株马立克氏病毒野毒株的分离与鉴定

2.2.1病料来源

2.2.2引物的设计与合成

2.2.3病毒分离

2.2.4间接免疫荧光实验（IFA）

2.2.5相关致病相关基因的PCR扩增、测序

2.3 三株马立克氏病毒的主要相关致病基因序列遗传变异分析

2.3.1相关致病基因 PCR 产物的克隆

2.3.2 三株MDV野毒株的主要致病基因的氨基酸序列分析以及系统进化树分析

2.4 三株MDV的致病性实验及毒力对比

2.4.1实验设计

2.4.2临床观察

2.4.3组织病理切片的制备

3 结果与分析

3.1三株MDV野毒株的分离与鉴定

3.1.1临床及病理变化

3.1.2病毒分离及鉴定

3.1.3三株MDV野毒株的体外增殖特性

3.1.4相关致病基因PCR扩增

3.1.5三株马立克氏病毒与致病性相关基因的序列遗传变异分析结果

3.2三株马立克氏病病毒的毒力对比及致病性分析

3.2.1三株病毒的效价测定

3.2.2攻毒后临床症状及病理变化观察

3.2.3解剖观察

3.2.4病理组织学观察

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文情况