死亡鸭胚中常见病毒的分离鉴定及序列分析

摘要

近年来，种鸭蛋在孵化过程中出现死亡的比率不断升高，经常出现孵化过程中胚胎致死、鸭胚爆裂、恶臭等现象，刚出壳的雏鸭表现为弱雏、营养不良等，严重制约我国养鸭业的发展。本研究对山东临沂地区孵化场的死亡鸭胚进行病毒分离鉴定，确定主要引起鸭胚死亡的病原体，并进行病毒目的基因的扩增和遗传进化分析，现将结果报道如下：
　　1、病毒的分离、鉴定：采集死亡鸭胚的尿囊液进行坦布苏病毒、新型鹅细小病毒、H9亚型禽流感病毒、血清4型I群禽腺病毒和新型鸭呼肠孤病毒的PCR检测，对存在混合感染的样品进行中和试验使其成为单一毒株，过滤除菌后，接种于9日龄健康鸭胚并收集尿囊液按照常规病毒分离方法进行盲传3代，自盲传至3代以后，病毒液可导致鸭胚于3~4 d内死亡，并致使鸭胚胚体水肿、出血。对收集的尿囊液经PCR或RT-PCR检测，并对扩增的目的片段进行测序，进行遗传进化分析。
　　2、不同分离株目的基因的扩增及遗传进化分析：对坦布苏病毒、新型鹅细小病毒、H9亚型禽流感病毒、血清4型I群禽腺病毒和新型鸭呼肠孤病毒设计特异性引物进行目的片段扩增、测序，对目的片段进行遗传进化分析。结果表明，TMUV-LY株核苷酸序列与Genbank上已发表的TMUV同源性为98.1%，说明坦布苏病毒的变异较小；NGPV-LY株与GPV分离株核苷酸序列同源性为93.3%~96.3%，而与MDPV同源性为81.9%~90.8%，表明该分离株与鹅细小病毒同源性较近而与番鸭细小病毒的核苷酸同源性较远，分离株与欧洲的鹅细小病毒在同一分支上，与番鸭细小病毒在不同的分支上，很有可能是该种病毒是从鹅传播到鸭上并引起变异；H9N2-LY株与A/Duck/Hong Kong/Y439/97株高度同源，而与 A/Duck/Hong Kong/Y280/97株（ AF156376）、A/Quail/Hong Kong/G1/97株（AF156378）的核苷酸同源性仅为84%，说明当前H9的流行毒株很有可能是Y439毒株； FAV4-LY株与印度分离株亲缘关系较近，核苷酸同源性在99.6%~99.8%之间，与欧洲株和美洲株核苷酸同源性在98.7%~99.1%之间，分离株与韩国株比较核苷酸同源性为98.6%。遗传进化树结果显示，该分离株与印度株在同一个分支上，并与俄罗斯株在一个大支上，韩国株与欧洲、美洲株位于另一支上；NDRV-LY株与Genbank上已发表的NDRV的同源性为95.5%~97.6%，基因核苷酸变异较小，引起的较小变异很有可能是在使用疫苗时引起的变异。
　　本试验对临床上引起鸭胚死亡的病毒进行分离鉴定，确定了引起死亡的主要的病毒，为我国种鸭场病毒的净化提供流行病学依据。

目录

声明

英文缩写

1前言

1.1 鸭群中主要的病毒病

1.1.1鸭坦布苏病毒

1.1.2 鸭源新型鹅细小病毒

1.1.3 H9N2亚型禽流感病毒

1.1.4 血清4型I群禽腺病毒

1.1.5 新型鸭源呼肠孤病毒

1.2 病毒常见的检测方法

1.2.1免疫学诊断

1.2.2 分子生物学诊断

1.3研究的目的和意义

2.1 材料

2.1.1 病料与鸭胚

2.1.2仪器

2.1.3 试剂

2.2 方法

2.2.1病毒的分离和纯化

2.2.2 目的基因的扩增

2.2.3 目的片段的纯化及测序

3 结果

3.1 死亡鸭胚剖检变化

3.2病毒的分离与鉴定

3.2.1 PCR检测结果

3.2.2 序列分析

3.3 五种病毒感染统计结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

附录