DG1调控拟南芥花粉发育及花粉管在雌蕊组织中生长的研究

摘要

被子植物花粉在柱头表面的萌发与生长依赖花粉与柱头的相互识别。而这一识别机制的研究能让人们更好的理解授粉过程中雄配子体与雌蕊组织的相互作用。内吞作用通过将胞外物质、膜蛋白以及脂类转运到细胞内，参与调控植物的生长发育以及信号转导过程。研究表明网格蛋白介导的内吞在调控花粉管生长以及花粉管与雌蕊组织的互作中起作用。但是花粉管的内吞作用调控花粉管与雌蕊组织互作的分子机制还不清楚。 拟南芥Defective Pollen Tube Growth1（DG1）基因编码的蛋白属于衔接蛋白类似物。DG1在12时期的花粉中开始表达，并且在萌发后的花粉管顶端也有表达。DG1定位于花粉管的亚顶端细胞质及质膜。研究表明DG1参与网格蛋白介导的内吞。 为了研究DG1在花粉发育中的作用，我们利用CRISPR/Cas9技术对DG1进行突变，得到了一个DG1翻译提前终止的突变体dg1-3/+。对此突变体的花粉进行亚历山大染色观察，发现有一半的花粉形态异常且不能萌发。进一步观察发现突变体花粉从12时期开始出现胼胝质的异常积累，同时纤维素及果胶质的分布也存在不同程度的异常。 为了研究DG1在花粉管生长中的作用，我们构建了雌激素诱导的通过artificial microRNA 技术降低DG1表达的pER8::amiRNA-DG1载体。其拟南芥转基因株系的花粉能够在经过雌激素处理的柱头表面萌发，花粉管可以在柱头乳突细胞表面生长，但是无法生长进入花柱的引导组织。这一结果表明，DG1调控花粉管在雌蕊组织中的生长。 为进一步研究DG1调控花粉管生长的机制，我们利用酵母双杂交的方法筛选拟南芥花粉的cDNA文库，寻找DG1内吞的货物蛋白。我们筛选到了果胶甲酯酶PME和膜定位的钾离子通道蛋白SPIK与DG1互作，进而利用膜蛋白酵母双杂交系统和Pull-down技术确认它们与DG1互作。内吞过程中，衔接蛋白通过结合货物蛋白中保守的Y-X-X-Phi氨基酸位点参与货物蛋白的内吞。不同物种的SPIK同源序列比对发现，拟南芥SPIK中含有保守的Y-I-L-V序列。将该序列的Y突变后，SPIKY436S不能与DG1的μHD结构域互作，表明DG1可能通过识别SPIK的Y-I-L-V序列调控其内吞。在pPME::PME-RFP转基因植株中，PME-RFP定位于花粉管顶端的质膜及细胞壁上，而且其定位受到内吞抑制剂Tyr A23的影响。进一步，我们分离到了拟南芥PME的T-DNA插入的敲除突变体pme，发现pme突变体与dg1-3突变体花粉的表型相类似，花粉从第12时期开始出现胼胝质的异常积累以及形态的异常，最终表现为花粉败育。为了揭示PME是否影响花粉管在柱头表面的生长，我们构建了pER8::amiRNA-PME的载体转化拟南芥，观察转基因株系花粉在雌激素处理过的柱头表面的生长情况。这些结果将有助于我们更好的分析DG1调控花粉管在柱头表面生长的作用机制。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1被子植物雄配子体的结构和发育过程

1.2花粉与雌蕊组织的相互作用

1.3网格蛋白依赖的内吞途径

1.4植物果胶甲酯酶PME

1.5果胶甲酯酶抑制因子PMEI

1.6钾离子通道蛋白

1.7本实验的目的与意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 DG1在花粉中的表达及定位

3.2 DG1新突变体的创造

3.3 dg1-3/+突变体花粉的表型分析

3.4 dg1-3/+突变体的互补

3.5 pER8::amiRNA-DG1转基因植株表型观察

3.6 DG1互作蛋白的筛选和验证

3.7 DG1通过识别SPIK中Y-I-L-V序列与之结合

3.8 PME亚细胞定位

3.9 pme突变体花粉表型分析

4 讨论

（1）DG1参与的内吞调控花粉管在雌蕊组织中的生长

（2）花粉管中的PME可能影响柱头表面的细胞壁硬度

（3）DG1可能参与柱头乳突细胞信号分子的识别

5 结论

参考文献

致谢