禾谷镰刀菌烯酰基辅酶A水合酶的功能研究

摘要

禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是小麦赤霉病主要的致病真菌，寄主范围主要是禾谷类作物。镰刀菌侵染会使产量和品质下降，残留的真菌毒素如玉米赤霉烯酮类（Zearalenone, ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivallenol, DON）严重危害健康。同时，DON也是重要的致病因子，在小麦的侵染与致病中发挥重要作用。烯酰基辅酶A水合酶（enoyl-CoA hydratase，Ech1）能够降解脂肪酸，是脂肪酸β-氧化的重要过程。但是，在植物病原真菌中了解甚少。为此，我们对禾谷镰刀菌FgEch1进行了研究。 采用生物信息学的方法在禾谷镰刀菌基因组中得到一个FgEch1基因。利用Split-marker的方法构建禾谷镰刀菌FgEch1基因敲除载体，通过PEG介导的原生质体转化法获得FgEch1基因敲除突变体?Ech1和回复菌株?Ech1-C。分析FgEch1基因敲除突变体的相关表型变化, 阐明FgEch1在禾谷镰刀菌中的功能。 突变体具有下列的特征：1）突变体?Ech1对菌落生长没有影响。2）突变体影响短链脂肪酸的利用。在含正丁酸和正己酸的MM培养基上相对生长速率分别下降74.23%、100%，在含肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸的MM培养基上的相对生长速率分别下降14.27%、13.12%、8.28%；3）突变体?Ech1影响孢子产量和萌发率。突变体?Ech1相对于野生型菌株产孢量下降了80.19%；分生孢子在6 h和24 h萌发率分别下降56.85%、13.25%；4）突变体对小麦的致病性减弱。小麦穗接种结果发现，突变体的致病能力下降，麦穗接种后病情指数下降86.7%；5）突变体?Ech1对H2O2的胁迫敏感性升高。在含有0、1、5、10mM浓度梯度H2O2的CM培养基上生长，H2O2对菌丝的抑制率分别提高7.533%、8.505%、12.918%； 6）突变体?Ech1和野生型菌株PH-1之间对有性生殖无影响。 上述结果表明，FgEch1对无性生殖，短链脂肪酸的利用和致病性发挥着重要的作用。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1小麦赤霉病研究进展

1.1.1 小麦赤霉病概况

1.1.2 禾谷镰刀菌的生物学特性

1.1.3 禾谷镰刀菌致病基因的研究进展

1.1.4 小麦赤霉病防治措施

1.2 脂肪酸β-氧化与烯酰辅酶A水合酶

1.2.1脂肪酸运输与β-氧化

1.2.2 过氧化物酶体β-氧化

1.2.3 烯酰基CoA水合酶

1.2.4 真菌烯酰基CoA水合酶研究现状

1.3 该项研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株和载体

2.1.2工具酶和主要试剂

2.1.2 主要溶液配制配方

2.1.3 培养基配制方法

2.2实验方法

2.2.1 禾谷镰刀菌FgEch1 基因结构分析

2.2.2 禾谷镰刀菌的保存和培养

2.2.3 提取禾谷镰刀菌基因组DNA

2.2.4 酵母和大肠杆菌质粒DNA提取方法

2.2.5 普通PCR扩增反应

2.2.6 PCR产物纯化和DNA琼脂糖凝胶胶回收

2.2.7 构建禾谷镰刀菌FgEch1 基因敲除载体

2.2.8 原生质体制备和转化

2.2.9 PCR验证敲除转化子

2.2.10 Southern blot验证敲除转化子

2.2.11 禾谷镰刀菌FgEch1基因回复

2.2.12 从生物学表型分析FgEch1 基因敲除突变体

3 结果与分析

3.1 禾谷镰刀菌FgEch1结构和进化树分析

3.1.1禾谷镰刀菌FgEch1基因的获得

3.2 禾谷镰刀菌FgEch1基因的敲除

3.2.1 敲除载体构建过程

3.2.2 验证敲除突变体

3.3 获得禾谷镰刀菌FgEch1回复菌株

3.3.1 构建FgEch1基因回复载体和回复菌株转化

3.3.2 验证回复菌株?Ech1-C

3.4 FgEch1基因敲除突变体的表型观察

3.4.1 FgEch1基因不影响菌落生长

3.4.2 FgEch1基因调控脂肪酸的利用

3.4.3 FgEch1基因影响孢子产量与孢子萌发

3.4.4 FgEch1基因不影响有性生殖

3.4.5 FgEch1基因调控菌株致病性

3.4.6 FgEch1基因调控对H2O2胁迫敏感性

4 讨论

5 总结与展望

5.1 实验总结

5.2 研究展望

参考文献

致谢