检测新型鹅细小病毒抗体的间接ELISA方法的建立及应用

摘要

自2014年下半年来，我国安徽、江苏、山东等肉鸭养殖地区的樱桃谷鸭爆发了一种以鸭喙萎缩变短、舌外伸、生长发育障碍等为主要症状的传染病，暂时命名为鸭“短喙-侏儒综合症”（short beak and dwarfism syndrome, SBDS），民间俗称“鸭大舌病”。研究人员通过病毒的分离鉴定和动物回归试验，确定该病的病原为一种新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus, NGPV)，与鹅细小病毒（Goose parvovirus, GPV）属于同一进化支，两者核苷酸相似率95%以上。本研究通过建立优化一种适合临床检测NGPV抗体的间接 ELISA方法，为NGPV的血清学诊断提供一种可靠的技术手段，利用该方法调查了来自不同地区的鸭血清样本，丰富了当下NGPV研究的血清学调查数据。具体研究内容如下： NGPV衣壳蛋白的原核表达及纯化：参照Genbank中NGPV的衣壳蛋白基因序列，分别设计扩增VP1与VP3基因的引物，从实验室保存的NGPV阳性病料中提取病毒D NA，以NGPV阳性DNA为模板扩增VP1与VP3基因，分别将 VP1和VP3基因片段连接到 pET-32a(+)表达载体上，构建pETVP1与pETVP3重组质粒，将重组质粒转化到E. coli BL21（DE3)表达菌中进行蛋白表达。利用尿素梯度法纯化表达后的DE3菌体蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定 VP1蛋白浓度为2.18 μg/μL，VP3蛋白浓度为3.7 μg/μL。Western blot试验表明，本试验所表达的VP1和VP3蛋白能够与NGPV阳性血清发生特异反应，不与其他病原的阳性血清及健康鸭血清反应。 鸭血清中NGPV抗体检测的间接ELISA方法的建立及优化：分别应用VP1与VP3蛋白作为ELISA方法的包被抗原，在同等条件下检测相同NGPV阳性血清与健康鸭血清，ELISA结果显示VP3蛋白作为包被抗原的P/N值远高于VP1蛋白作为包被抗原的值，选取VP3蛋白作为包被抗原更为灵敏可靠，因此选用NGPV的VP3蛋白作为包被抗原用于建立检测血清中NGPV抗体的ELISA方法。 经过条件的摸索与优化，ELISA检测方法的最佳条件为：VP3蛋白包被浓度为2μg/mL；封闭液选择5%脱脂奶粉（250μL/孔），封闭2h；样本血清进行400倍稀释（100μL/孔），37℃条件下孵育1.5h；羊抗鸭二抗进行4000倍稀释（100μL/孔），37℃封闭2h；TMB显色液（100μL/孔）避光作用10min。应用建立的间接 ELISA方法检测 36份 NGPV阴性鸭血清，根据统计学原理计算该 ELISA 方法的临界值，当血清样品的 OD450 值S≥0.2024时，样品为阳性；当样品的OD450值S≤0.183时，样品为阴性。对建立的ELISA 方法进行特异性检验，结果表明该方法不与鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）、禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）、鸭瘟病毒（duck plague virus,DPV）的抗体发生交叉反应。重复性检验结果显示，同一样本在同一批次试验和不同批次的试验中数值差异极小，表明该间接ELISA方法具有良好的重复性。使用间接ELISA方法和中和试验两种方法检测120份血清样品，结果显示这两种检测方法的符合率为85.8%。 间接ELISA检测方法的临床应用：本研究应用建立的用于NGPV 抗体检测的ELISA方法对山东省5个鸭场共计970份血清样品进行检测。结果表明，5个鸭场的群体NGPV阳性率为100%，每个鸭场的个体阳性率从17.6%-62.6%不等，潍坊个体检出率最高（62.6%），泰安地区两鸭场的个体检出率较低，其中新泰场检出率为17.6%，肥城场检出率为26.0%，970份血清样品的平均阳性率为39.7%。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1鹅细小病毒病概述

1.2 鹅细小病毒的病原研究进展

1.3 GPV的非结构蛋白与结构蛋白

1.4 GPV临床症状及病理变化

1.5 GPV检测方法研究进展

1.6 GPV与NGPV的防治

1.7本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3 结果与分析

3.1 NGPV 分离鉴定

3.2 NGPV VP1和VP3蛋白表达结果

3.3间接ELISA检测方法的建立

4讨论

4.1 检测新型鹅细小病毒抗体的间接ELISA方法的优点

4.2 NGPV蛋白的表达纯化

4.3 NGPV ELISA检测方法的建立

4.4 NGPV 抗体ELISA检测方法的应用

5结论

参考文献

致谢