猪核糖核酸酶L的原核表达、鉴定及与PRRSV蛋白的互作研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，给世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失。2006年，我国爆发了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，以高热、高发病率和高致死率为典型特征。 核糖核酸酶(RNase L)是最重要的抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP)之一，是由干扰素诱导产生的，参与机体特异性免疫和非特异性免疫，在机体的抗病毒过程中起到着非常重要的作用。活化的核糖核酸酶L切割单链RNA，包括病毒RNA和细胞RNA。激活后的RNase L通过对病毒RNA的水解作用致使蛋白合成受到抑制，以减少病毒复制。然而，RNase L与PRRSV的蛋白互作影响病毒的复制、增殖未见任何研究报道。我们的研究共分为以下三个部分： 扩增sRNase L目的基因，并克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，将构建好的重组质粒pGEX-4T-sRNase L转化到宿主表达菌BL21，经IPTG诱导，获得可溶性表达的蛋白，利用rTEV蛋白酶切除GST标签，验证蛋白功能。结果显示sRNase L蛋白具有切割RNA的功能。 我们将PRRSV的所有编码蛋白基因和sRNase L基因克隆至Luciferase互作系统的两个质粒，通过Luciferase试验，我们筛选到与sRNase L互作的PRRSV的蛋白是Nsp4、Nsp12和N。经免疫共沉淀（Co-IP）验证，PRRSV的Nsp4、Nsp12和N蛋白均与sRNase L互作。间接免疫荧光（IFA）结果进一步表明，Nsp4、Nsp12和N蛋白均与sRNase L在细胞内存在共定位。 RNase L在机体的抗病毒免疫过程中发挥着重要的作用，但sRNase L对PRRSV的抗病毒作用和机制尚未阐明。N sp4 是病毒复制过程中最重要的蛋白水解酶，具有切割蛋白的功能。Nsp12蛋白的功能目前还没有研究，可能在病毒的转录过程中起一定的作用。N蛋白是病毒的核衣壳蛋白，在病毒的组装过程中发挥重要作用。本研究发现PRRSV的Nsp4、Nsp12和N蛋白均与sRNase L互作，可能是sRNase L通过与三个蛋白的互作，影响了其在 PRRSV 复制、转录、组装中的作用，进而起到了抗 PRRSV的效果。本研究为进一步深入研究sRNase L抗PRRSV的机制奠定了重要基础，并为PRRSV的感染和防控提供了新的思路和方法。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1 PRRSV的基本特征

1.2 PRRSV引起宿主的免疫学反应

1.3 RNase L的研究进展

1.4本研究的意义

2 材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

2.3 Luciferase筛选与sRNase L互作的PRRSV的蛋白

2.4 Co-IP鉴定与sRNase L互作的PRRSV的蛋白

2.5 IFA鉴定与sRNase L互作的PRRSV的蛋白

3.试验结果

3.1 sRNase L原核表达蛋白的制备及功能鉴定结果

3.2 Luciferase筛选与sRNase L互作的PRRSV的蛋白

3.3 Co-IP鉴定sRNase L互作的PRRSV的蛋白

3.4 IFA共定位鉴定与sRNase L互作的PRRSV的蛋白

4.讨论

5.结论

参考文献

致谢

攻读学位期间论文发表情况