水貂阿留申疾病的双重PCR检测方法建立及其应用

摘要

水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease, AMD）作为毛皮动物三大疫病之一，对水貂养殖业造成巨大的经济损失。因其特殊的发病机理，尚无有效的药物或疫苗来防治此病，只能通过对貂群检疫净化淘汰来控制病情。目前主要采用的针对抗体检测的对流免疫电泳法（CIEP）在对阿留申疾病的发病前期检测存在敏感性差问题，并且对部分康复水貂检测仍显示阳性，不利于进行阿留申病的抗病育种筛选；以及近年来随着阿留申病毒的不断传播和变异，普通病原检测方法常出现漏检的状况。双重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感高、特异强等优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用。目前，在我国水貂群中AMDV普遍存在，应用双重PCR方法检测AMDV的方法还没有建立。 本研究通过参考GenBank上已发表的AMDV序列进行比对，选择在NS1基因的保守区和VP2基因的保守区分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物NS1-F/NS1-R和一对针对VP2基因片段的特异性引物VP2-F/VP2-R，建立双重PCR检测方法。通过单一PCR均能扩增出相应的目的条带:NS1目的片段为568bp，VP2目的片段412bp。对目的条带进行胶回收、连接转化以及质粒鉴定，最终测序证明本研究所设计的两对引物所扩增的目的片段均为AMDV的片段。然后对单一PCR进行特异性试验、灵敏性试验和重复性试验，结果表明所设计的两对引物具有良好的特异性，不与其他常见病原反应，同时其灵敏度高达10pg/μL，具有良好的重复性。在单一PCR反应条件的基础上，釆用方阵试验对引物浓度、退火温度等条件进行反复摸索调整，得到双重PCR方法的最佳反应条件，经过特异性试验和灵敏性试验，最低可检测到102个拷贝的病毒DNA，同时可重复性强。本试验中NS1扩增片段为568bp，VP2扩增片段为412bp，相差156bp，用1%的琼脂糖凝胶跑电泳可以明显区别目的条带片段，达到了通过眼观直接判断的要求。本研究建立了高特异性高灵敏性的双重PCR方法，该方法可重复性强，为水貂阿留申病的检疫提供了一种新的检测方法，为水貂养殖业进行AMDV净化的可靠技术手段。 应用该方法对水貂示范场4次送检血液样品检测：2016年9月份所送检样品964份，共检出54份为阳性，其总阳性率为5.60%；2016年12月份所送检样品6996份，共检出218份阳性，其总阳性率3.12%；2017年6月份所送检样品2647份，共检出77 份为阳性，其总阳性率2.91%；2017年11月份所送检样品3356份，共检出85份为阳性，其总阳性率2.53%。根据前后4次对该水貂示范场的AMDV的检测，并结合该示范场实际状况，配合相应生物安全措施，最终该示范场中AMDV的总体阳性率明显下降。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1病原学

1.2 AMDV的流行病学

1.3 AMDV的诊断

1.4 水貂示范场生物安全体系的建立

1.5本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 单重PCR方法建立

2.4 双重PCR方法建立

2.5.山东地区某示范水貂场AMDV的检疫净化

3.结果

3.1 NS1和VP2基因片段的PCR扩增结果

3.2 重组载体的酶切鉴定结果

3.3 测序结果与样品毒株比较

3.4 单重PCR测试结果

3.5 双重PCR检测结果

3.6 山东地区某水貂示范场AMDV的检测结果

4.讨论

4.1双重PCR方法的建立

4.2阿留申疾病的检疫

5 结论

参考文献

致谢