苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2.2应答干旱和盐胁迫调控糖含量的分子机制

摘要

苹果是中国北方地区重要的种植果树，产量和出口量均居全球首位。非生物胁迫比如干旱、低温、盐碱和养分亏缺等已经成为限制果树产量、降低果实品质的主要因素，严重制约了果树产业的可持续安全发展。植物识别逆境信号后，该信号就在细胞之间和整株植物中传递。逆境信号的传递通常会引起细胞水平上基因表达的变化。它又接着影响整株植株的代谢和发育。高等植物在分子和细胞水平上发生变化，以适应环境胁迫。 糖在植物的生理代谢、生长和发育过程中具有重要功能。糖是主要的光合产物，同时也是植物韧皮部运输的主要成分，也可以作为信号分子调控植株的生长与发育。在非生物胁迫条件下，糖能够调节植物体内的渗透势，维持细胞渗透压并且保护细胞。糖转运蛋白能够起到运输糖的作用，也能够调控植物体内的糖含量。但目前，对苹果中糖转运蛋白如何调控糖积累的机制，还不是很清楚。 因此，我们对苹果中蔗糖转运蛋白MdSUT2.2功能进行研究。论文研究发现： 1、苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2.2与拟南芥蔗糖转运蛋白AtSUT2有很高的同源性。在拟南芥中，异位表达MdSUT2.2基因降低了植株对于蔗糖的敏感性。异位表达 MdSUT2.2增加了转基因植株蔗糖转运活性。研究结果表明拟南芥中过量表达MdSUT2.2能够加速植物生长和提前开花。在苹果愈伤组织和拟南芥中，过表达MdSUT2.2显着提高了植物对非生物胁迫（NaCl，ABA和甘露醇）抗性。总之，这些结果证明苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2.2参与调控非生物胁迫抗性和植物生长发育。 2、MdSUT2.2和MdAREB2被克隆并遗传转化到苹果中以验证它们在ABA诱导糖积累过程中的作用。研究结果发现转录因子MdAREB2结合到糖转运蛋白和淀粉酶基因的启动子并激活它们的表达促进可溶性糖积累。过量表达MdAREB2和MdSUT2.2植株都比野生型产生更多的可溶性糖。此外，MdAREB2转基因植株通过 MdSUT2.2促进可溶性糖的积累。 3、转录因子MdAREB2在ABA信号途径中起到重要作用。与野生型对照相比，过表达MdAREB2增加了转基因植株对脱落酸ABA的敏感性。此外，研究发现在ABA处理下，MdAREB2蛋白在411位苏氨酸（Thr）处被磷酸化。酵母双杂证明蛋白激酶MdCIPK22与MdAREB2相互作用。他们的互作通过Pull-Down和Co-IP进一步被证明。MdCIPK22是ABA诱导MdAREB2蛋白磷酸化所必需的，并增强蛋白MdAREB2稳定性和转录活性。最后，我们发现转基因植株MdCIPK22以依赖MdAREB2的方式增加对ABA敏感性。 4、此外，我们进一步发现MdCIPK22能够与MdSUT2.2直接互作。双分子荧光互补（BiFC） ，Pull-down和 Co-immunoprecipitation（Co-IP）进一步证明 MdCIPK22与MdSUT2.2的相互作用。过表达蔗糖转运蛋白MdSUT2.2促进了转基因苹果植株的糖积累和耐旱性。质谱鉴定结果表明蛋白MdSUT2.2在381位丝氨酸（Ser）发生磷酸化。一系列转基因分析表明，蛋白激酶MdCIPK22是干旱诱导MdSUT2.2发生磷酸化所必需的，并且MdCIPK22增强了MdSUT2.2蛋白的稳定性。最后研究结果发现MdCIPK22通过MdSUT2.2促进糖积累和改善植株的耐旱性。 5、与WT对照相比，过表达MdSUT2.2基因提高了转基因苹果的耐盐性。另外，我们研究发现在盐处理下MdSUT2.2蛋白的254位丝氨酸（Ser）发生磷酸化。利用膜系统筛库，找到蛋白激酶MdCIPK13与MdSUT2.2相互作用。一系列转基因分析表明MdCIPK13是MdSUT2.2蛋白发生磷酸化所必需的，并且增强了蛋白MdSUT2.2的稳定性。最后，我们的结果证明MdCIPK13通过MdSUT2.2改善了苹果植株的耐盐性。 6、此外，我们研究结果发现苹果MdSOS2L1具有调节根部苹果酸外泌和抑制镉吸收进入根部的作用。通过苹果cDNA文库筛选，找到蛋白激酶MdSOS2L1与苹果酸转运 蛋 白 MdALMT14互 作 。 双 分 子 荧 光 互 补（BiFC） ，Pull-down和 Co-Immunoprecipitation（Co-IP）分析进一步证明MdSOS2L1与MdALMT14的相互作用。转基因分析表明MdSOS2L1是MdALMT14蛋白发生磷酸化所必需的，并且这种磷酸化修饰提高了蛋白MdALMT14的稳定性。最后，我们的结果显示MdSOS2L1以依赖MdALMT14的方式增强植株对于Cd2+离子的耐受性。 我们的研究结果发现在果树和其它果实作物的生产中，适度的干旱或者盐胁迫或ABA处理能够促进植株或者果实中的可溶性糖积累，从而提高果实的风味品质。在以上的研究中，我们首先确定了苹果中蔗糖转运蛋白MdSUT2.2在ABA诱导的可溶性糖积累中具有重要作用，而MdAREB2是苹果应答ABA和干旱信号、激活MdSUT2.2等基因表达的关键转录因子。这些研究结果表明，ABA或干旱诱导的蛋白激酶MdCIPK22能够磷酸化转录因子MdAREB2，使其高效地激活淀粉酶和糖转运蛋白基因的表达，最终促进可溶性糖在液泡中积累，提高植物的抗逆性和果实品质。此外蛋白激酶MdCIPK22和MdCIPK13能够和MdSUT2.2互作并且发生磷酸化。蛋白的磷酸化修饰提高糖转运蛋白稳定性，促进植株可溶性糖的积累并且改变植株渗透势，提高植株的抗逆性。 我们的研究揭示了在果树中适度的非生物胁迫能够促进果实品质，从而为开发新的栽培技术提高果实质量提供了理论指导。在苹果中开展相关研究，有助于拓展人们对植物（特别是多年木本果树）逆境应答的分子机制的认识，具有重要理论意义；同时，也为我国苹果等果树的抗逆栽培和果树产业的可持续发展提供科技支撑。

目录

声明

符 号 说 明

1前言

1.1 植物与糖

1.2 植物与苹果酸

1.3 非生物胁迫

1.4 糖与非生物胁迫

1.5 有机酸与镉（Cd）胁迫

1.6 研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 MdSUT2.2功能初步鉴定

3.2 转录因子MdAREB2调控基因MdSUT2.2的表达

3.3 MdCIPK22与MdAREB2相互作用并发生磷酸化

3.4 蔗糖转运蛋白MdSUT2.2参与干旱胁迫并发生磷酸化

3.5 MdSUT2.2与MdCIPK13互作，被MdCIPK13磷酸化

3.6 MdSOS2L1与MdALMT14相互作用，提高苹果对重金属的耐受性

3.7 MdSUT2.2参与调控糖积累和非生物胁迫以及MdALMT14参与重金属胁迫的模式图

4讨论

4.1 MdSUT2.2调控植物的生长与发育

4.2 MdAREB2在ABA信号途径中的作用

4.3 MdAREB2通过调控MdSUT2.2的表达参与糖信号

4.4 MdCIPK22与MdSUT2.2互作，参与调控干旱胁迫

4.5 MdCIPK13与MdSUT2.2互作，参与调控盐胁迫

4.6 MdSOS2L1通过MdALMT14调控重金属的抗性

5 结论

参考文献

7 附录

7.1 本文所用引物

7.2本文所用载体示意图

致谢

9 攻读学位期间发表的论文