基于转录组的五个小麦族物种NBS基因家族系统进化分析

摘要

小麦族（Triticeae）是禾本科（Poaceae）中一个重要的族，不仅包括小麦、大麦等重要麦类作物，还包含冰草、新麦草等优良牧草，是一个粮饲兼用的族。小麦族蕴藏着众多优异抗病基因，为普通小麦（Triticum aestivumL.)的抗病育种提供了极其丰富的抗病基因资源。其中，NBS基因家族是植物细胞内普遍存在的主要抗性基因家族。本研究完成了五个物种RNA提取、测序、组装，在转录组水平利用生物信息学方法挖掘NBS抗病基因家族序列。利用系统发生学以及进化生物学的方法对物种间NBS基因家族进化模式进行系统分析。主要结果如下： 1.五个小麦族物种转录组测序与组装：对提莫菲维小麦（Triticum timopheevii）、茹科夫斯基小麦（Triticum zhukovskyi）、小伞山羊草（Aegilops umbellulata）、尾状山羊草（Aegilops caudata）、黑麦（Secale Cereal）进行二代、三代转录组测序。采用“三+二”模式，利用二代无参组装数据对三代全长转录组数据进行校正，得到高质量的转录本。提莫菲维小麦、茹科夫斯基小麦、小伞山羊草、尾状山羊草、黑麦的转录本数量分别为97653、58207、43573、49870、91170，N50的长度分别为1434、1742、1856、1764、1972bp。 2. 同源性搜索及鉴定：对提莫菲维小麦、茹科夫斯基小麦、小伞山羊草、尾状山羊草、黑麦五个物种蛋白序列进行同源性搜索，阈值设为1e-50，同源性搜索的结果分别为50、96、40、68、160条，共414条。从植物抗病基因数据库下载有胚植物代表性NBS蛋白序列，与候选NBS蛋白序列快速构建序列进化树，发现没有单独独立出来的分支，表明同源检索得到的414条蛋白序列可以作为NBS基因表达蛋白的同源序列进行后续分析。 3. NBS 基因家族分类：对鉴定的候选蛋白序列进行分类，发现五个物种中只存在CC-NBS-LRR（CNL）类抗病基因，与先前研究者们单子叶植物中只存在 CNL 类基因的结论一致。根据C末端LRR结构域的有无，可分为NBS-LRR和NBS两类。其中， NBS-LRR类蛋白序列分别为：33、59、27、38、111条，NBS类蛋白序列分别为17、37、13、30、49条。 4. 序列比对和保守结构域分析：将鉴定的NBS蛋白序列与水稻中NBS蛋白序列进行多重序列比对，比对结果中查找到五个物种NBS结构存在公认的P-loop（GGLGKTT）、Kinase-2（LLVLDDVW）、Kinase-3（GSRVLLTTR）、GLPL 区（GGLPLA）四个保守基序，表明五个物种NBS蛋白序列相对保守。 5. 系统进化分析：利用最大似然法构建地钱为外群的系统进化树，这些序列分为明显的两支，表明NBS基因家族是由两个分支进化而来。它们可进一步划分为三组，由于五个物种不同类型NBS蛋白序列在三组中均有分布，且存在于不同的进化枝中，不存在单独的分枝，说明五个物种的进化模式不存在单独的特点，而是有同样的进化模式。 6. 进化压力分析：计算三组同源基因对的同义替换率、非同义替换率以及它们之间的比率ω（=Ka/Ks）发现，旁系同源基因的同义替换率Ks值普遍高于直系同源基因，表明五个物种中大多数基因复制事件的时间要早于物种分离时间。除此之外，直系同源基因的Ka/Ks值普遍高于旁系同源基因，表明在进化过程中，直系同源基因受到的功能限制少，进化的进程更快。 7. 保守基序结构分析：在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均选择质量最高的15条CNL蛋白序列进行保守基序分析，结果表明，不同组之间保守基序的类别是不同的，同一组的不同序列间，基序模型也并不完全相同，基序类型、数目、排列顺序间均存在差异，据此推断五个物种是通过基序的频繁获得与丢失的方式进化的。此外，五个物种CNL蛋白序列的20类保守基序，长度变化较大，在15～50个氨基酸之间，这说明了NBS基因家族成员之间保守性相对较高。

目录

声明

符 号 说 明

1 引言

1.1 小麦族概述

1.2 植物抗病性

1.3 基因家族

1.4 高通量测序技术

1.5 本课题的研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 转录组测序结果

3.2 NBS基因家族同源序列搜索与鉴定

3.3 NBS基因家族同源序列的分类

3.4 序列比对和保守结构域分析

3.5 系统进化分析

3.6 进化压力计算

3.7 保守基序结构分析

4 讨论

4.1 转录组数据

4.2 NBS基因家族同源序列搜索与鉴定

4.3 NBS蛋白序列分类

4.4 系统进化分析

4.5 进化压力计算

5 结论

参考文献

致谢